Īņäåė ģīėåźóė’šķīé ćåķåņčźč ČŻĢ
Čńńėåäīāąķčå ģåņąėėīļšīņåčäīā
Лактоферрин
Этапы исследования
Некоторые свойства и структура ЛФ
Нахождение и место синтеза ЛФ в организме
Некоторые функции ЛФ
Лактоферрин как фактор роста
Бактериостатическое дейсттвие
ЛФ – белок острой фазы
Ингибирующее действие
Участие во внутриклеточном пищеварении
Влияние ЛФ на терморегуляцию
Производные ЛФ
Список литературы

Этапы исследования

Впервые лактоферрин (ЛФ) молока был описан в 1939 году [Sorensen & Sorensen,1939]. В 1969 году ЛФ был идентифицирован иммунологически и в гранулярном аппарате НГ человека и морской свинки [Masson et al., 1969]. ЛФ является маркерным белком специфических гранул НГ [Baggiolini et al., 1970]. В 1984 году была расшифрованапервичная структура ЛФ молока человека [Metz-Boutigue et al., 1984]. В 1991году была расшифрована первичная структура ЛФ молока коровы [Pierce et al.,1991].

Некоторые свойства и структура ЛФ

ЛФ выделен вначале из коровьего, затем из женского молока методами фракционирования сульфатом аммония (NH4)2SO4 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-сефадексе [Johansson, 1960; Айсен, 1978].

Строение ЛФ подобно строению других членов семейства ТФ. Этот белок состоит из одной полипептидной цепи с Mr ~ 80 кДа. По данным разных авторов этот гликопротеид имеет Mr ~ 76 кДа [Van Snick et al., 1974; Van Snick et al., 1977], 80-90 кДа [Bigene, 1984]. Вероятно, что ЛФ может быть представлен изоформами, поскольку авторы работы [Butler et al., 1988], при электрофорезе в полиакриламидном геле с ДДС-Na в очищенном ЛФ выявили 2 фракции с Mr ~ 78 и 80 кДа [Dawson et al., 1979], другие исследователи определили Mr ЛФ женского молока ~ 83 [Николаев & Аншакова, 1985] и 75 кДа [Немцова и др., 1988]. По молекулярной массе и аминокислотному составу он похож на ТФ, но отличается от него антигенной структурой. Определение первичной структуры показало, что длина полипептидной цепи составляет 680-700 аминокислот (ЛФ грудного молока, состоит из 691 аминокислотного остатка) [Metz-Boutigue et al., 1984] и может быть разделена на 2 гомологичные части (совпадают 35-40% аминокислот).

Гомологичные половины образуют глобулярные доли, соединенные спиральным участком из 11 аминокислот (остатки 333-344). Молекула белка не симметрична, так как доли повернуты друг относительно друга на ~ 180° и сдвинуты на 25 Å. Каждая из долей, в свою очередь, состоит из 2 доменов, в углублении между которыми расположен железо-связывающий сайт.

Такое строение позволяет предположить происхождение ЛФ вследствие дупликации гена предшественника, содержащего 1 железосвязывающий сайт и имеющего в 2 раза меньший размер, что, впрочем, характерно для всех ТФ.

Кристаллографическое исследование различных форм ЛФ позволило определить строение железосвязывающего сайта, а также подробности процесса связывания ионов железа с ЛФ [Anderson et al., 1984].

ЛФ в большом количестве содержится в молоке, является железосодержащим белком и образует с железом комплекс красного цвета, что и было отражено в его названии – red protein – красный белок [Johansson, 1960; Malmoquist et al., 1978, Sorensen & Sorensen, 1939]. Каждая молекула ЛФ прочно, связывает два иона Fe3+. Образование комплекса с ионами Fe3+ идет в присутствии бикарбонатных ионов:

2Fe3+ + 2HCO3– + ЛФ(H3)2 ® ЛФFe2(HCO3)2 + 6H+, l =460-470 нм [Masson, 1970].

При определенных условиях апоЛФ может присоединять Cu2+ и ионы некоторых других металлов: Zn2+, Cr3+, Co3+, Mn2+, Cd2+, Ni2+, связываемые теми же аминокислотами, которые обычно лигандируют Fe3+. Связывание железа сопровождается присоединением одного бикарбонатного иона в каждом сайте. Ион металла связывается с 4 боковыми цепями аминокислот и 2 атомами кислорода из аниона СО32-.

Конформационные изменения при связывании с ионами железа, обеспечивают образование более компактной структуры ЛФ. Присоединение ионов железа к этому белку меняет его изоэлектрическую точку с 9,2 на 8,5 за счет одновременного присоединения отрицательно заряженных бикарбонатных ионов [Айсен, 1978; Николаев & Аншакова, 1985]. Связанный атом железа прячется внутри белковой глобулы, что объясняет конформационную стабильность образованного комплекса в мочевине, по сравнению с апоформой белка. Несмотря на идентичность аминокислотных лигандов в металлосвязывающих центрах, аффиность ионов железа к белковой части ЛФ существенно выше (в 300 раз), чем у ТФ, даже при низких рН (рН=3). Показано, что сродство ЛФ к железу по сравнению с ТФ повышается в слабокислой среде, что и облегчает переход металла с ТФ на ЛФ при воспалении, когда рН тканей снижается за счет молочной и других кислот [Johansson, 1960; Malmoquist et al., 1978; Шубин & Нагоев, 1980]. ЛФ способен образовывать комплексы с ферментами, гепарином и отрицательно заряженными полимерами [Harte et al., 1984; Multigner et al., 1980; Айсен, 1978; Немцова и др., 1988; Николаев & Аншакова, 1985].

Углеводный компонент ЛФ состоит из остатков сиаловой (5-ацетамид-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулозоновой) кислоты, фукозы (6-деоксигалактозы), гексозы и N-ацетилглюкозамина и связан с белковой частью гликозидной связью через амидный азот аспарагина. Значение олигосахаридных цепей до конца не ясно: их удаление не оказывает регистрируемого действия на конформацию и функции ЛФ [Айсен, 1978].

Нахождение и место синтеза ЛФ в организме

ЛФ в большом количестве содержится в молозиве (0,67 г%) и грудном молоке (0,26 г%) [48], по другим данным 1280-3200 мкг\мл [Якубовская и др., 1986]. Кроме того, этот белок обнаружен в различных секретах экзокринных желез, включая слёзы, слюну (13 мкг/мл) [Николаев & Аншакова, 1985], семенную жидкость [Masson et al., 1966], и в панкреатическом соке, уровень ЛФ в котором связан с различными заболеваниями поджелудочной железы [Fedail et al., 1979; Figarella, 1980; Harte et al., 1984; Oram & Reiter, 1968]. В частности, отмечен постепенный рост его концентрации в чистом секрете при хроническом калькулезном панкреатите на стадии образования протеиновых пробок, а затем камней в протоках [Harte et al., 1984], понижение же уровня ЛФ выявлено при раке поджелудочной железы [Ellison & Giehl, 1991; Oram & Reiter, 1968]. ЛФ обнаружен также в секреторных гранулах лейкоцитов [Butler et al., 1988, Masson, 1970; Miyauchi & Watanabe, 1987], секретах респираторного, желудочно-кишечного и генитального трактов [Bigene, 1984; Chung et al., 1985], хотя в существенном количестве он содержится только в молоке. Также ЛФ обнаружен в молоке коров, свиней, мышей, но полностью отсутствует в молоке собак и крыс [Masson & Heremans, 1971].

Содержание ЛФ в сыворотке крови здоровых взрослых людей колеблется от 0,13 до 1,62 мкг/мл [Chung et al., 1985] при определении радиоиммунологическим и иммуноферментным методами. Разница может объясняться, как погрешностями и различными условиями при определении, так и этническими и географическими особенностями исследуемых популяций [Malmoquist et al., 1978; Сухарев и др., 1989]. Средняя концентрация ЛФ у здоровых астраханцев 1,05± 0,21 мкг/мл, а у москвичей – 0,26± 0,02 мкг/мл [Сухарев и др., 1989].

Грудное молоко содержит 3,6-12,5 мкмоль/л железа. Из этого количества 10-30% связаны с жировыми фракциями, преимущественно с наружной мембраной окружающей жировую глобулу; небольшая доля связана с казеином, остальное содержится в сыворотке и преимущественно связано с ЛФ [Fraanson & Lonnerdal; 1980], но также и с низкомолекулярными лигандами [Lonnerdal, 1984]. Таким образом, примерно 30% железа, содержащегося в молоке, связано с ЛФ, но только 6-8% ЛФ насыщены железом, то есть большая часть ЛФ находится в апоформе [Goldsmith et al., 1982].

В последнее время появляются данные о взаимодействии ЛФ с другими белками [Loughlin et al., 1987; Lu et al.]. Также было показано, что ЛФ связывается с нуклеиновыми кислотами, в частности, связывание с определенными последовательностями ДНК приводит к активации транскрипции [Maalen et al.].

Местом синтеза ЛФ молока, слюны, слез и других экскретов считаются железистые клетки соответствующих эпителиальных тканей [Chung et al., 1985], а ЛФ сыворотки – нейтрофилы [Masson et al., 1969; Miyauchi & Watanabe, 1987]. Установлены одинаковые физико-химические свойства и иммунохимическая идентичность экскреторного и сывороточного ЛФ [Кокряков и др., 1980; Немцова и др., 1988; Николаев & Аншакова, 1985]. Экстракты отмытых от культуральной жидкости фибробластов эмбриональной кожи человека после нескольких этапов деления in vitro содержат почти в 200 раз больше ЛФ, чем исходная культура клеток (соответственно 9000 и 47 нг/мл) [Сухарев и др., 1988].

Некоторые функции ЛФ

Основной особенностью ЛФ, определяющей спектр его многочисленных функций является его способность специфически связывать ионы железа и некоторых других металлов переходной группы. Функции, в основе которых лежит комплексообразующая способность ЛФ - детоксицирующая, транспортная, антимикробная [Oram & Reiter, 1968]. Несмотря на подробное изучение ЛФ в течение многих лет, его основная функция до сих пор не ясна.

Лактоферрин как фактор роста

Известно, что рост и развитие желудочно-кишечного тракта новорожденных животных, вскармливаемых материнским молоком, интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями [Heierd et al., 1984; Widdowson, 1985]. Nichols с соавторами, измеряя встраивание тимидина в ДНК клеток крысы in vitro, показали, что ЛФ человека является фактором, стимулирующим рост, причем такая способность ЛФ не зависит от наличия связанного железа. Это открытие увеличивает значимость ЛФ в желудочно-кишечном тракте ребенка: ЛФ не только является источником железа и аминокислот, но и способствует клеточному росту [Nichols et al., 1990].

Для подтверждения гипотезы о том, что ЛФ является фактором роста и описания возможного механизма его действия необходимы дальнейшие исследования.

Бактериостатическое дейсттвие

Создавая и поддерживая дефицитную по катионам железа и других металлов переменной валентности, необходимых для роста бактерий среду, ЛФ является одним из ведущих молекулярных факторов, сдерживающих размножение и рост бактерий и низших грибов на поверхности барьерных эпителиев и в условиях фаголизосом НГ [Bullen et al., 1978].

ЛФ посредством связывания ионов железа и других металлов переменной валентности из среды поверхностных структур оболочек микроорганизмов лишает последних жизненноважных микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз и супероксиддисмутаз, кроме этого, снижает их резистентность к токсическому действию химических реактивных производных кислорода. По мнению американского исследователя E. Weinberg, удержание железа ЛФ и ТФ во внутренней среде животного организма является одним из ведущих механизмов защиты от инфекций и опухолевого роста.

Однако, многие патогенные бактерии имеют специфические рецепторы, способные связывать ЛФ и утилизировать связанное с данным белком железо.

Бактериостатическое действие ЛФ в отношении микрофлоры – Streptococcus mutans, S. salivarius, S. mutior, S. pneumonial, Vibro cholerae 5698, Pseudomonas aeruginosa [Кокряков и др., 1989] присуще только ненасыщенному железом ЛФ – апоЛФ.

Известно, что ЛФ коровьего молока проявляет бактериостатическую активность по отношению к бактериям. Наиболее чувствительны к его действию оказались штаммы Еscherichia coli [Rainard, 1986], а некоторые штаммы Staphilococcus aureus проявляли устойчивость к ЛФ. Это заставляет предполагать, что механизм антибактериального действия ЛФ сложнее, нежели простое удаление железа из среды. Было показано, что ЛФ вызывает изменение проницаемости наружной мембраны некоторых грам-отрицательных бактерий [Ellison et al., 1988]. Дестабилизация клеточной стенки бактерий может быть результатом неспецифического связывания с ЛФ кальция и магния [Ellison & Laforce], т.е. ЛФ служит хелатором металлов, и его действие аналогично действию ЭДТА. Таким образом ЛФ способен выщеплять молекулы липосахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грамм-отрицательных бактерий, что происходит в результате связывания ЛФ Mg2+ и Ca2+, которые стабилизируют наружную мембрану. Возможно также взаимодействие электростатического характера слабоосновного ЛФ (pI~8,5) с карбоксильными группами в составе мембраны. Кроме того, вероятно дезорганизация оболочки бактерии приводит к активации вещества, вызывающего аутоповреждение [Ellison et al., 1980].

Совместное действие ЛФ с лизоцимом, также являющимся бактериостатиком и содержащемся в грудном молоке, может приводить к синергичному бактерицидному эффекту [Ellison & Giehl, 1991].

При бактериальных инфекциях и нагноительных процессах концентрация ЛФ нейтрофилов в плазме возрастает параллельно количеству нейтрофилов [Lima & Kierszenbaum, 1987; Van Snick et al., 1977; Yuan Hui Zhen et al., 1988]. При этом увеличивается транспорт железа с ТФ на ЛФ который, будучи нагруженным железом, переносит его клеткам ретикулоэндотелиальной системы, где железо откладывается в виде ферритина [Van Snick et al., 1974]. Вирусная инфекция приводит к снижению уровня ЛФ в нейтрофилах и плазме, несмотря на наличие лейкоцитоза при вирусных заболеваниях [Baynes et al., 1986]. Снижение сывороточного ЛФ отмечается также при радиоактивном облучении, введении цитостатиков и кортикостероидов [Bayens et al., 1988; Bigene, 1984].

Склонность больных, перенесших вирусные заболевания, к последующим бактериальным осложнениях согласуется с тем фактом, что лица с врожденной или приобретенной недостаточностью ЛФ восприимчивы к возрастной инфекции [Baynes et al., 1986], и свидетельствует о биологической роли ЛФ в защите организма [Bigene, 1984].

ЛФ – белок острой фазы

ЛФ плазмы крови синтезируется в нейтрофильных гранулах и выбрасывается оттуда в русло крови, причем во время воспаления количество высвобождающегося ЛФ возрастает в десятки раз [Leffel & Spitznagel, 1975; Maalen et al.]. Предполагаемая роль ЛФ в такой ситуации – встраивать ионы железа из трансферрина и доставлять их из плазмы в макрофаги эндоплазматического ретикулума (эндоплазматической цепи), удаляя их таким образом из очага воспаления. Низкое значение pH в очаге воспаления обеспечивает минимальную активность кислых гидролаз и пероксидазы первичных гранул, что в свою очередь активирует лизоцим и ЛФ во вторичных гранулах, и эти реакции характерны для начального периода фагоцитоза [Шубин & Нагоев, 1980]. Кроме того, ЛФ катализирует продукцию гидроксильных радикалов, оказывающих выраженное окислительное, разрушающее антибактериальное действие [Айсен, 1978]. Одновременно, ЛФ защищает нейтрофилы и другие лейкоциты от окислительного повреждения, ингибируя перекисное окисление липидов [Gutteidge et al., 1981]. Это позволяет говорить о ЛФ, как о белке острой фазы.

Ингибирующее действие

Отмечен ряд ингибирующих влияний ЛФ на различные звенья иммунных и воспалительных реакций [Johansson, 1960]. Ингибирующее действие ЛФ находится в обратной зависимости от степени насыщенности его железом. ЛФ человека в определенной дозе супрессирует выработку антител мышиными моноцитами in vitro [Duncan & McArthur, 1981], а также уменьшает количество гранулоцитов и моноцитов in vivo [Gentile & Broxmeyer, 1983]. Что обуславливает участие ЛФ в регуляции миелпоэза.

Участие во внутриклеточном пищеварении

Возможно, что все клетки животных и растений, чтобы выжить имеют “внутриклеточный пищеварительный аппарат”, образованный лизосомной системой. В систему входят совокупность мембранных пузырьков, пребывающих в постоянном изменении, лизосомы, которые содержат кислые гидролазы для “очищения” клетки и поглощения бесполезного клеточного материала. Именно эти кислые гидролазы находятся в первичных гранулах многоядерных нейтрофилов, тогда как вторичные или специфические гранулы этих лейкоцитов содержат фосфатазу, часть лизоцима и ЛФ [De Duve & Wattiaux, 1966]. В момент фагоцитоза происходит параллельное внеклеточное освобождение кислых гидролаз и ЛФ. Во всех клетках организма лизосомный аппарат обеспечивает переваривание материалов внеклеточного происхождения (гетерофагия) и материалов самой клетки (аутофагия). В секреторных клетках лизосомы, кроме того, обеспечивают функцию кринофагии, что позволяет поглощать избыток секреторных компонентов и поддерживать гомеостаз желез внешней секреции. В связи с этим предполагается участие ЛФ в процессах внутриклеточного пищеварения.

Влияние ЛФ на терморегуляцию

В настоящее время выясняется связь ЛФ с повышением температуры тела, продукцией интерлейкинов и воспалительными реакциями [Barak & Тreves, 1988; Baynes et al., 1986; Loughlin et al., 1987]. Повышение температуры является одним из физиологических сигналов для запуска каскада адаптационных реакций с выработкой и взаимодействием различных медиаторов воспаления [Schmidt & Abdulla, 1988].

Производные ЛФ

Бактерицидные свойства ЛФ в отношении некоторых видов микроорганизмов могут быть объяснены образованием коротких основных (катионных) пептидов N-концевых участков белка путем ограниченного протеолиза. Пептиды ЛФ крупного рогатого скота с аминокислотной последовательностью 1-54 и более короткий 1-41, так называемый лактоферрицин В [Bellamy et al., 1992], обладают еще большим, чем ЛФ микробоцидным действием, которое объясняется выраженной основностью аминокислотной последовательности на концах молекул этих пептидов [Ellison & Laforce; Кокряков, 1999; Кокряков и др., 1989].

Список литературы
  1. Anderson B.F., Baker H.M., Dodson E.J. et al. Structure of human lactoferrin at 3.2-Å resolution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 1769-1773.
  2. Baggiolini M., De Duve C., Masson P.L. Heremans J.F. Assotiation of Lactoferrin with specific granules in rabbit neutrophil leukocytes// J.Exp. Med. (USA). 1970. Vol. 131, N 3. P. 559-570.
  3. Barak V., Тreves A.I. // Lymphokine Res. – 1988. – Vol. 7, N3. – p. 268.
  4. Bayens R.D., Bezwoda W.R., Mansoor N. // Amer. J. Clin. Path. – 1988. – Vol. 89, N 2. – P. 225-228.
  5. Baynes R.D., Bezwoda W.R., Khan O., Mansoor N. // Scand. J. Haemat. – 1986. – Vol. 36. – P. 79-84.
  6. Bellamy W., Tekase M., Yamauchi K. et al. Identification of the backtericidal domain of lactoferrin // Biochim. Et biophys. Acta. 1992. Vol. 40. P. 309-312.
  7. Bigene H.S. // Scand. J. Haemat. – 1984. – Vol. 33. – P. 225-230.
  8. Bullen J.J., Rogers H.J., Griffiths E. Role of iron in bacterial infection// Curr. Top. Microbiol. And Immunol. 1978. Vol. 80. P. 1-35.
  9. Butler Th.W., Heck L.W., Huster W.J. et al. // J. Immunol. Meth. – 1988. – Vol. 108, N 1-2. – P. 159-170.
  10. Chung S., Hayward C., Brock D. // Ibid. – 1985. – Vol. 84. – P. 135-141.
  11. Dawson J.H., Dooley D.M., Clark R., Stephens P.J., Gray H.B. Spectroscopic studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites. // J. Am. Chem. Soc. 1979. Vol. 101, P. 5046-5053.
  12. De Duve C., Wattiaux R. // Ann. Rev. Physiol. – 1966. Vol. 28. – P. 435-492.
  13. Duncan R.L., McArthur W.P. // Cell. Immunol. – 1981. – Vol. 63. – P. 308-320.
  14. Ellison R.T. & Giehl T.J. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. // J. Clin. Invest. 1991. Vol. 88, P. 1080-1091.
  15. Ellison R.T., Giehl T.J. & Laforce F.M. Damage of the outer Membrane of enteric dram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. // Infect. Immun. 1988. Vol. 56, P. 2774-2781.
  16. Ellison R.T., Giehl T.J., LaForce F. Damage of the oute membrane of electric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin// Infect. And Immun. 1988. Vol. 56. P. 2774-2781.
  17. Ellison R.T., Laforce F.M. Giehl T.J. Boose D.S. & Dunn B.E. Lactoferrin and transferrin damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca+2 and Mg+2. // J. Gen. Microbiol. Vol. 136, P. 1437-1446.
  18. Fedail S.S., Harvey R.F., Salmon K.R. et al. // Gut. – 1979. – Vol. 63. – 308-320.
  19. Figarella C. // Gastroent. Clin. Biol. – 1980. – Vol. 4. – P. 631-635.
  20. Fraanson G.B. & Lonnerdal B. Iron in human milk. // J. Pediatr. Res. 1980. Vol. 2, P. 693-701.
  21. Gentile P., Broxmeyer H.E. // Blood. – 1983. – Vol. 61, N 5. – P. 982-993.
  22. Goldsmith S.J., Eitenmiller R.R., Barnhart H.M., Toledo R.T. & Rao V.N. Unsaturated iron-binding capacity of human milk. // J. Fd. Sci. 1982. Vol. 47, P. 1298-1304.
  23. Gutteidge I.M.C., Paterson S.K., Segal A.W., Halliwell B. // Biochem. J. – 1981. – Vol. 199. – P. 259-261.
  24. Harte J., Figarella C., Fossot Ch. et al. // Path. Biol. – 1984. – Vol. 32, N 4. – P. 239-244.
  25. Heierd W.C., Schwarz S.M., & Hansen I.H. Colostrum-induced enteric mucosal growth in beagle puppies. // Pediatr. 1984. Res. 18, P. 512-515.
  26. Johansson B. // Acta Chem. Scand. – 1960. – Vol. 14. – p. 510-512.
  27. Leffel M.S. & Spitznagel J.K. Fate of human lactoferrin and myeloperoxidase in phagocytosing human heutophils: effects of immunoglobulin G subslasses and immune complexes coated on latex beads. // infect. Immunol. 1975. Vol. 12, P. 813-820.
  28. Lima M.F., Kierszenbaum F. // J. Immunol. – 1987. – Vol. 139, N 5. – P. 566-571.
  29. Lonnerdal B. Iron in Breast milk. In iron nutrition in infancy and childhood, ed. A. Stekel. // Vol. 4, P. 95-118. Nestle Nutrition Workshop Series. New York: Vevey/Raven Press. 1984.
  30. Loughlin K.R., Gittes R.F., Partritge D., Stelos P. // Cancer (Philad.). – 1987. – Vol. 59. – P.566-571.
  31. Lu Y., Roe J.A., Gralla E.B., Valentine J.S. Metalloprotein ligand redesign: characterization of cooper-cysteinate proteins derived from yeast copper-zinc superoxide dismutase. // Chapman & Hall, New York; P. 64-77.
  32. Maalen H., Sheppard K. & Fletcher J. The discharge of primary and secondary granules during immune phagocytosis by normal and chronic granulocytic leukaemia polymorphonuclear neutrophils. // Br. J. Haematol. Vol. 51, P. 201-208.
  33. Malmoquist J., Hansen N.E., Karle S.H. // Scand J. Haemat. – 1978. – Vol. 21, N 1. – P. 5-8.
  34. Masson P.L. & Heremans J.F. Lactoferrin in milk from different species. // Comp. Biochem. Physiol. 1971. Vol. 39B, P. 119-129.
  35. Masson P.L. La lactoferrin. Proteine des secretions externes et des leukocyte neutrophiles. Bruxelles, 1970. P. 232.
  36. Masson P.L. La Lactoferrine. Proteine des secretion externes et des leucocytes neutrophiles. // Edition Arsci S.A., Bruxelles. 1970.
  37. Masson P.L., Heremans J.F., Dive C. // Clin. Chim. Acta. – 1966. Vol. 14. – P. 735-738.
  38. Masson P.L., Heremans J.F., Schonne E. // J. Exp. Med. – 1969. – Vol. 130. – P. 643-658.
  39. Masson P.L., Heremans J.F., Schonne E. Lactoferrin, an iron-binding protein in neutrophilic leukocytes// J.Exp. Med. (USA). 1969. Vol. 130, N 3. P. 643-658.
  40. Metz-Boutigue M.N., Jolles J., Mazurier J.et al. Human lactoferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrin// Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 145, N 3. P. 659-676.
  41. Miyauchi J., Watanabe Y. // Cell Tiss. Res. – 1987. – Vol. 247. – P. 249-258.
  42. Multigner L., Figarella C., Sahel H. et al. // Dig.,Dis. Sci. – 1980. – Vol. 25, N 3. – P. 173-178.
  43. Nichols B.L., McKee K.S. & Heubert H.A. Iron is not required in the lactoferrin stimulation of thymidine incorporation into the DNA of rat crypt enterocytes. // Pediatr. 1990. Res. 27. P. 525-528.
  44. Oram J.D., Reiter B. Inhibition of bacteria by lactoferrin and other iron-chelating agents//Biochim. et Biophys. Acta. 1968. Vol. 170, N 3. P 351-365.
  45. Pierce A., Colavizza D., Bennassa M., et al. Molecular cloning and sequence analysis of bovine lactotransferrin// Eur.J. Biochem. 1991. Vol. 196. P. 177-184.
  46. Rainard P. Bacteriostatic activity of bovine milk lactoferrin against mastitic bacteria. // Vet. Microbiol. 1986. Vol. 11, P. 387-392.
  47. Schmidt J.A., Abdulla E. // Lymphokine Res. – 1988. – Vol. 7. N 3. – P. 262-268.
  48. Sorensen M., Sorensen J.P.L. The proteins in whey//C. R. Trav. Lab. Carlsberg. 1939. Vol. 23, N 1. P.55-99.
  49. Van Snick I.L., Masrkowetz B., Masson P. // Ibid. – 1977. – Vol. 146. – P. 817-827.
  50. Van Snick I.L., Masson P., Heremans J. // J. Exp. Med. – 1974. – Vol. 140, N 4. – P. 1068-1084.
  51. Widdowson E.M. Development of the digestive system: comparative animal studies. // Am. J. Clin. Nutr. 1985. Vol. 41. P. 384-390.
  52. Yuan Hui Zhen, Maacks S., Granam W.W. // J. Bioluminesc. Chemilumines. – 1988. – Vol. 2, N 4. – P. 278-284.
  53. Айсен П.// Неорганическая биохимия. – М., 1978. – Т.1. – С. 333-360.
  54. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. – СПб.: Наука, 1999. – 162 с.
  55. Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Слепкова С.В. и др. // Биохимия. – 1988. Т. 53, № 11. – С. 1837-1843.
  56. Кокряков В.Р., Пигаревский В.Е., Алешина Г.М., Шамова О.В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при фагоцитозе//Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций/Сб. науч. Трудов под ред. А.Н. Маянского. Горький, 1989. С. 98-103.
  57. Немцова Е.Р., Якубовкая Р.И., Уткин М.М. // Вопр. Мед. Химии. – 1988. - №3. – С. 127-131.
  58. Николаев АА., Аншакова Н.И. // Вопр. Мед. Химии. – 1985. - №3. – С. 128- 131.
  59. Сухарев А.Е. Николаев А.А., Терехов С.М., Хайрулин Ю.Х. // Мед. Реф. Журн. XXI. – 1989. - №3 – Публ. 495.
  60. Сухарев А.Е., Николаев АА, Васильев Ю.М. и др. // Мед. Реф. Журн. XVIII. – 1988. - №10. – Публ. 1157.
  61. Шубин М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. М., 1980. – С. 22-23.
  62. Якубовская Р.И., Немцова Е.Р., Коханова И.Д. и др. // Вопр. Мед. Химии. – 1986. №6. – С. 75-79.

 ЛактоферринЭтапы исследования
Некоторые свойства и структура ЛФ
Нахождение и место синтеза ЛФ в организме
Некоторые функции ЛФ
Лактоферрин как фактор роста
Бактериостатическое дейсттвие
ЛФ – белок острой фазы
Ингибирующее действие
Участие во внутриклеточном пищеварении
Влияние ЛФ на терморегуляцию
Производные ЛФ
Список литературы

Этапы исследования

Впервые лактоферрин (ЛФ) молока был описан в 1939 году [Sorensen & Sorensen,1939]. В 1969 году ЛФ был идентифицирован иммунологически и в гранулярном аппарате НГ человека и морской свинки [Masson et al., 1969]. ЛФ является маркерным белком специфических гранул НГ [Baggiolini et al., 1970]. В 1984 году была расшифрованапервичная структура ЛФ молока человека [Metz-Boutigue et al., 1984]. В 1991году была расшифрована первичная структура ЛФ молока коровы [Pierce et al.,1991].

Некоторые свойства и структура ЛФ

ЛФ выделен вначале из коровьего, затем из женского молока методами фракционирования сульфатом аммония (NH4)2SO4 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-сефадексе [Johansson, 1960; Айсен, 1978].

Строение ЛФ подобно строению других членов семейства ТФ. Этот белок состоит из одной полипептидной цепи с Mr ~ 80 кДа. По данным разных авторов этот гликопротеид имеет Mr ~ 76 кДа [Van Snick et al., 1974; Van Snick et al., 1977], 80-90 кДа [Bigene, 1984]. Вероятно, что ЛФ может быть представлен изоформами, поскольку авторы работы [Butler et al., 1988], при электрофорезе в полиакриламидном геле с ДДС-Na в очищенном ЛФ выявили 2 фракции с Mr ~ 78 и 80 кДа [Dawson et al., 1979], другие исследователи определили Mr ЛФ женского молока ~ 83 [Николаев & Аншакова, 1985] и 75 кДа [Немцова и др., 1988]. По молекулярной массе и аминокислотному составу он похож на ТФ, но отличается от него антигенной структурой. Определение первичной структуры показало, что длина полипептидной цепи составляет 680-700 аминокислот (ЛФ грудного молока, состоит из 691 аминокислотного остатка) [Metz-Boutigue et al., 1984] и может быть разделена на 2 гомологичные части (совпадают 35-40% аминокислот).

Гомологичные половины образуют глобулярные доли, соединенные спиральным участком из 11 аминокислот (остатки 333-344). Молекула белка не симметрична, так как доли повернуты друг относительно друга на ~ 180° и сдвинуты на 25 Å. Каждая из долей, в свою очередь, состоит из 2 доменов, в углублении между которыми расположен железо-связывающий сайт.

Такое строение позволяет предположить происхождение ЛФ вследствие дупликации гена предшественника, содержащего 1 железосвязывающий сайт и имеющего в 2 раза меньший размер, что, впрочем, характерно для всех ТФ.

Кристаллографическое исследование различных форм ЛФ позволило определить строение железосвязывающего сайта, а также подробности процесса связывания ионов железа с ЛФ [Anderson et al., 1984].

ЛФ в большом количестве содержится в молоке, является железосодержащим белком и образует с железом комплекс красного цвета, что и было отражено в его названии – red protein – красный белок [Johansson, 1960; Malmoquist et al., 1978, Sorensen & Sorensen, 1939]. Каждая молекула ЛФ прочно, связывает два иона Fe3+. Образование комплекса с ионами Fe3+ идет в присутствии бикарбонатных ионов:

2Fe3+ + 2HCO3– + ЛФ(H3)2 ® ЛФFe2(HCO3)2 + 6H+, l =460-470 нм [Masson, 1970].

При определенных условиях апоЛФ может присоединять Cu2+ и ионы некоторых других металлов: Zn2+, Cr3+, Co3+, Mn2+, Cd2+, Ni2+, связываемые теми же аминокислотами, которые обычно лигандируют Fe3+. Связывание железа сопровождается присоединением одного бикарбонатного иона в каждом сайте. Ион металла связывается с 4 боковыми цепями аминокислот и 2 атомами кислорода из аниона СО32-.

Конформационные изменения при связывании с ионами железа, обеспечивают образование более компактной структуры ЛФ. Присоединение ионов железа к этому белку меняет его изоэлектрическую точку с 9,2 на 8,5 за счет одновременного присоединения отрицательно заряженных бикарбонатных ионов [Айсен, 1978; Николаев & Аншакова, 1985]. Связанный атом железа прячется внутри белковой глобулы, что объясняет конформационную стабильность образованного комплекса в мочевине, по сравнению с апоформой белка. Несмотря на идентичность аминокислотных лигандов в металлосвязывающих центрах, аффиность ионов железа к белковой части ЛФ существенно выше (в 300 раз), чем у ТФ, даже при низких рН (рН=3). Показано, что сродство ЛФ к железу по сравнению с ТФ повышается в слабокислой среде, что и облегчает переход металла с ТФ на ЛФ при воспалении, когда рН тканей снижается за счет молочной и других кислот [Johansson, 1960; Malmoquist et al., 1978; Шубин & Нагоев, 1980]. ЛФ способен образовывать комплексы с ферментами, гепарином и отрицательно заряженными полимерами [Harte et al., 1984; Multigner et al., 1980; Айсен, 1978; Немцова и др., 1988; Николаев & Аншакова, 1985].

Углеводный компонент ЛФ состоит из остатков сиаловой (5-ацетамид-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулозоновой) кислоты, фукозы (6-деоксигалактозы), гексозы и N-ацетилглюкозамина и связан с белковой частью гликозидной связью через амидный азот аспарагина. Значение олигосахаридных цепей до конца не ясно: их удаление не оказывает регистрируемого действия на конформацию и функции ЛФ [Айсен, 1978].

Нахождение и место синтеза ЛФ в организме

ЛФ в большом количестве содержится в молозиве (0,67 г%) и грудном молоке (0,26 г%) [48], по другим данным 1280-3200 мкг\мл [Якубовская и др., 1986]. Кроме того, этот белок обнаружен в различных секретах экзокринных желез, включая слёзы, слюну (13 мкг/мл) [Николаев & Аншакова, 1985], семенную жидкость [Masson et al., 1966], и в панкреатическом соке, уровень ЛФ в котором связан с различными заболеваниями поджелудочной железы [Fedail et al., 1979; Figarella, 1980; Harte et al., 1984; Oram & Reiter, 1968]. В частности, отмечен постепенный рост его концентрации в чистом секрете при хроническом калькулезном панкреатите на стадии образования протеиновых пробок, а затем камней в протоках [Harte et al., 1984], понижение же уровня ЛФ выявлено при раке поджелудочной железы [Ellison & Giehl, 1991; Oram & Reiter, 1968]. ЛФ обнаружен также в секреторных гранулах лейкоцитов [Butler et al., 1988, Masson, 1970; Miyauchi & Watanabe, 1987], секретах респираторного, желудочно-кишечного и генитального трактов [Bigene, 1984; Chung et al., 1985], хотя в существенном количестве он содержится только в молоке. Также ЛФ обнаружен в молоке коров, свиней, мышей, но полностью отсутствует в молоке собак и крыс [Masson & Heremans, 1971].

Содержание ЛФ в сыворотке крови здоровых взрослых людей колеблется от 0,13 до 1,62 мкг/мл [Chung et al., 1985] при определении радиоиммунологическим и иммуноферментным методами. Разница может объясняться, как погрешностями и различными условиями при определении, так и этническими и географическими особенностями исследуемых популяций [Malmoquist et al., 1978; Сухарев и др., 1989]. Средняя концентрация ЛФ у здоровых астраханцев 1,05± 0,21 мкг/мл, а у москвичей – 0,26± 0,02 мкг/мл [Сухарев и др., 1989].

Грудное молоко содержит 3,6-12,5 мкмоль/л железа. Из этого количества 10-30% связаны с жировыми фракциями, преимущественно с наружной мембраной окружающей жировую глобулу; небольшая доля связана с казеином, остальное содержится в сыворотке и преимущественно связано с ЛФ [Fraanson & Lonnerdal; 1980], но также и с низкомолекулярными лигандами [Lonnerdal, 1984]. Таким образом, примерно 30% железа, содержащегося в молоке, связано с ЛФ, но только 6-8% ЛФ насыщены железом, то есть большая часть ЛФ находится в апоформе [Goldsmith et al., 1982].

В последнее время появляются данные о взаимодействии ЛФ с другими белками [Loughlin et al., 1987; Lu et al.]. Также было показано, что ЛФ связывается с нуклеиновыми кислотами, в частности, связывание с определенными последовательностями ДНК приводит к активации транскрипции [Maalen et al.].

Местом синтеза ЛФ молока, слюны, слез и других экскретов считаются железистые клетки соответствующих эпителиальных тканей [Chung et al., 1985], а ЛФ сыворотки – нейтрофилы [Masson et al., 1969; Miyauchi & Watanabe, 1987]. Установлены одинаковые физико-химические свойства и иммунохимическая идентичность экскреторного и сывороточного ЛФ [Кокряков и др., 1980; Немцова и др., 1988; Николаев & Аншакова, 1985]. Экстракты отмытых от культуральной жидкости фибробластов эмбриональной кожи человека после нескольких этапов деления in vitro содержат почти в 200 раз больше ЛФ, чем исходная культура клеток (соответственно 9000 и 47 нг/мл) [Сухарев и др., 1988]. 

Некоторые функции ЛФ

Основной особенностью ЛФ, определяющей спектр его многочисленных функций является его способность специфически связывать ионы железа и некоторых других металлов переходной группы. Функции, в основе которых лежит комплексообразующая способность ЛФ - детоксицирующая, транспортная, антимикробная [Oram & Reiter, 1968]. Несмотря на подробное изучение ЛФ в течение многих лет, его основная функция до сих пор не ясна.

Лактоферрин как фактор роста

Известно, что рост и развитие желудочно-кишечного тракта новорожденных животных, вскармливаемых материнским молоком, интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями [Heierd et al., 1984; Widdowson, 1985]. Nichols с соавторами, измеряя встраивание тимидина в ДНК клеток крысы in vitro, показали, что ЛФ человека является фактором, стимулирующим рост, причем такая способность ЛФ не зависит от наличия связанного железа. Это открытие увеличивает значимость ЛФ в желудочно-кишечном тракте ребенка: ЛФ не только является источником железа и аминокислот, но и способствует клеточному росту [Nichols et al., 1990].

Для подтверждения гипотезы о том, что ЛФ является фактором роста и описания возможного механизма его действия необходимы дальнейшие исследования.

Бактериостатическое действие

Создавая и поддерживая дефицитную по катионам железа и других металлов переменной валентности, необходимых для роста бактерий среду, ЛФ является одним из ведущих молекулярных факторов, сдерживающих размножение и рост бактерий и низших грибов на поверхности барьерных эпителиев и в условиях фаголизосом НГ [Bullen et al., 1978].

ЛФ посредством связывания ионов железа и других металлов переменной валентности из среды поверхностных структур оболочек микроорганизмов лишает последних жизненно-важных микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз и супероксиддисмутаз, кроме этого, снижает их резистентность к токсическому действию химических реактивных производных кислорода. По мнению американского исследователя E. Weinberg, удержание железа ЛФ и ТФ во внутренней среде животного организма является одним из ведущих механизмов защиты от инфекций и опухолевого роста.

Однако, многие патогенные бактерии имеют специфические рецепторы, способные связывать ЛФ и утилизировать связанное с данным белком железо.

Бактериостатическое действие ЛФ в отношении микрофлоры – Streptococcus mutans, S. salivarius, S. mutior, S. pneumonial, Vibro cholerae 5698, Pseudomonas aeruginosa [Кокряков и др., 1989] присуще только ненасыщенному железом ЛФ – апоЛФ.

Известно, что ЛФ коровьего молока проявляет бактериостатическую активность по отношению к бактериям. Наиболее чувствительны к его действию оказались штаммы Еscherichia coli [Rainard, 1986], а некоторые штаммы Staphilococcus aureus проявляли устойчивость к ЛФ. Это заставляет предполагать, что механизм антибактериального действия ЛФ сложнее, нежели простое удаление железа из среды. Было показано, что ЛФ вызывает изменение проницаемости наружной мембраны некоторых грам-отрицательных бактерий [Ellison et al., 1988]. Дестабилизация клеточной стенки бактерий может быть результатом неспецифического связывания с ЛФ кальция и магния [Ellison & Laforce], т.е. ЛФ служит хелатором металлов, и его действие аналогично действию ЭДТА. Таким образом ЛФ способен выщеплять молекулы липосахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грамм-отрицательных бактерий, что происходит в результате связывания ЛФ Mg2+ и Ca2+, которые стабилизируют наружную мембрану. Возможно также взаимодействие электростатического характера слабоосновного ЛФ (pI~8,5) с карбоксильными группами в составе мембраны. Кроме того, вероятно дезорганизация оболочки бактерии приводит к активации вещества, вызывающего аутоповреждение [Ellison et al., 1980].

Совместное действие ЛФ с лизоцимом, также являющимся бактериостатиком и содержащемся в грудном молоке, может приводить к синергичному бактерицидному эффекту [Ellison & Giehl, 1991].

При бактериальных инфекциях и нагноительных процессах концентрация ЛФ нейтрофилов в плазме возрастает параллельно количеству нейтрофилов [Lima & Kierszenbaum, 1987; Van Snick et al., 1977; Yuan Hui Zhen et al., 1988]. При этом увеличивается транспорт железа с ТФ на ЛФ который, будучи нагруженным железом, переносит его клеткам ретикулоэндотелиальной системы, где железо откладывается в виде ферритина [Van Snick et al., 1974]. Вирусная инфекция приводит к снижению уровня ЛФ в нейтрофилах и плазме, несмотря на наличие лейкоцитоза при вирусных заболеваниях [Baynes et al., 1986]. Снижение сывороточного ЛФ отмечается также при радиоактивном облучении, введении цитостатиков и кортикостероидов [Bayens et al., 1988; Bigene, 1984].

Склонность больных, перенесших вирусные заболевания, к последующим бактериальным осложнениях согласуется с тем фактом, что лица с врожденной или приобретенной недостаточностью ЛФ восприимчивы к возрастной инфекции [Baynes et al., 1986], и свидетельствует о биологической роли ЛФ в защите организма [Bigene, 1984].

ЛФ – белок острой фазы

ЛФ плазмы крови синтезируется в нейтрофильных гранулах и выбрасывается оттуда в русло крови, причем во время воспаления количество высвобождающегося ЛФ возрастает в десятки раз [Leffel & Spitznagel, 1975; Maalen et al.]. Предполагаемая роль ЛФ в такой ситуации – встраивать ионы железа из трансферрина и доставлять их из плазмы в макрофаги эндоплазматического ретикулума (эндоплазматической цепи), удаляя их таким образом из очага воспаления. Низкое значение pH в очаге воспаления обеспечивает минимальную активность кислых гидролаз и пероксидазы первичных гранул, что в свою очередь активирует лизоцим и ЛФ во вторичных гранулах, и эти реакции характерны для начального периода фагоцитоза [Шубин & Нагоев, 1980]. Кроме того, ЛФ катализирует продукцию гидроксильных радикалов, оказывающих выраженное окислительное, разрушающее антибактериальное действие [Айсен, 1978]. Одновременно, ЛФ защищает нейтрофилы и другие лейкоциты от окислительного повреждения, ингибируя перекисное окисление липидов [Gutteidge et al., 1981]. Это позволяет говорить о ЛФ, как о белке острой фазы.

Ингибирующее действие

Отмечен ряд ингибирующих влияний ЛФ на различные звенья иммунных и воспалительных реакций [Johansson, 1960]. Ингибирующее действие ЛФ находится в обратной зависимости от степени насыщенности его железом. ЛФ человека в определенной дозе супрессирует выработку антител мышиными моноцитами in vitro [Duncan & McArthur, 1981], а также уменьшает количество гранулоцитов и моноцитов in vivo [Gentile & Broxmeyer, 1983]. Что обуславливает участие ЛФ в регуляции миелпоэза.

Участие во внутриклеточном пищеварении

Возможно, что все клетки животных и растений, чтобы выжить имеют “внутриклеточный пищеварительный аппарат”, образованный лизосомной системой. В систему входят совокупность мембранных пузырьков, пребывающих в постоянном изменении, лизосомы, которые содержат кислые гидролазы для “очищения” клетки и поглощения бесполезного клеточного материала. Именно эти кислые гидролазы находятся в первичных гранулах многоядерных нейтрофилов, тогда как вторичные или специфические гранулы этих лейкоцитов содержат фосфатазу, часть лизоцима и ЛФ [De Duve & Wattiaux, 1966]. В момент фагоцитоза происходит параллельное внеклеточное освобождение кислых гидролаз и ЛФ. Во всех клетках организма лизосомный аппарат обеспечивает переваривание материалов внеклеточного происхождения (гетерофагия) и материалов самой клетки (аутофагия). В секреторных клетках лизосомы, кроме того, обеспечивают функцию кринофагии, что позволяет поглощать избыток секреторных компонентов и поддерживать гомеостаз желез внешней секреции. В связи с этим предполагается участие ЛФ в процессах внутриклеточного пищеварения.

Влияние ЛФ на терморегуляцию

В настоящее время выясняется связь ЛФ с повышением температуры тела, продукцией интерлейкинов и воспалительными реакциями [Barak & Тreves, 1988; Baynes et al., 1986; Loughlin et al., 1987]. Повышение температуры является одним из физиологических сигналов для запуска каскада адаптационных реакций с выработкой и взаимодействием различных медиаторов воспаления [Schmidt & Abdulla, 1988].

Производные ЛФ

Бактерицидные свойства ЛФ в отношении некоторых видов микроорганизмов могут быть объяснены образованием коротких основных (катионных) пептидов N-концевых участков белка путем ограниченного протеолиза. Пептиды ЛФ крупного рогатого скота с аминокислотной последовательностью 1-54 и более короткий 1-41, так называемый лактоферрицин В [Bellamy et al., 1992], обладают еще большим, чем ЛФ микробоцидным действием, которое объясняется выраженной основностью аминокислотной последовательности на концах молекул этих пептидов [Ellison & Laforce; Кокряков, 1999; Кокряков и др., 1989]

Список литературы

  1. Anderson B.F., Baker H.M., Dodson E.J. et al. Structure of human lactoferrin at 3.2-Å resolution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 1769-1773.

  2. Baggiolini M., De Duve C., Masson P.L. Heremans J.F. Assotiation of Lactoferrin with specific granules in rabbit neutrophil leukocytes// J.Exp. Med. (USA). 1970. Vol. 131, N 3. P. 559-570.

  3. Barak V., Тreves A.I. // Lymphokine Res. – 1988. – Vol. 7, N3. – p. 268.

  4. Bayens R.D., Bezwoda W.R., Mansoor N. // Amer. J. Clin. Path. – 1988. – Vol. 89, N 2. – P. 225-228.

  5. Baynes R.D., Bezwoda W.R., Khan O., Mansoor N. // Scand. J. Haemat. – 1986. – Vol. 36. – P. 79-84.

  6. Bellamy W., Tekase M., Yamauchi K. et al. Identification of the backtericidal domain of lactoferrin // Biochim. Et biophys. Acta. 1992. Vol. 40. P. 309-312.

  7. Bigene H.S. // Scand. J. Haemat. – 1984. – Vol. 33. – P. 225-230.

  8. Bullen J.J., Rogers H.J., Griffiths E. Role of iron in bacterial infection// Curr. Top. Microbiol. And Immunol. 1978. Vol. 80. P. 1-35.

  9. Butler Th.W., Heck L.W., Huster W.J. et al. // J. Immunol. Meth. – 1988. – Vol. 108, N 1-2. – P. 159-170.

  10. Chung S., Hayward C., Brock D. // Ibid. – 1985. – Vol. 84. – P. 135-141.

  11. Dawson J.H., Dooley D.M., Clark R., Stephens P.J., Gray H.B. Spectroscopic studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites. // J. Am. Chem. Soc. 1979. Vol. 101, P. 5046-5053.

  12. De Duve C., Wattiaux R. // Ann. Rev. Physiol. – 1966. Vol. 28. – P. 435-492.

  13. Duncan R.L., McArthur W.P. // Cell. Immunol. – 1981. – Vol. 63. – P. 308-320.

  14. Ellison R.T. & Giehl T.J. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. // J. Clin. Invest. 1991. Vol. 88, P. 1080-1091.

  15. Ellison R.T., Giehl T.J. & Laforce F.M. Damage of the outer Membrane of enteric dram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. // Infect. Immun. 1988. Vol. 56, P. 2774-2781.

  16. Ellison R.T., Giehl T.J., LaForce F. Damage of the oute membrane of electric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin// Infect. And Immun. 1988. Vol. 56. P. 2774-2781.

  17. Ellison R.T., Laforce F.M. Giehl T.J. Boose D.S. & Dunn B.E. Lactoferrin and transferrin damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca+2 and Mg+2. // J. Gen. Microbiol. Vol. 136, P. 1437-1446.

  18. Fedail S.S., Harvey R.F., Salmon K.R. et al. // Gut. – 1979. – Vol. 63. – 308-320.

  19. Figarella C. // Gastroent. Clin. Biol. – 1980. – Vol. 4. – P. 631-635.

  20. Fraanson G.B. & Lonnerdal B. Iron in human milk. // J. Pediatr. Res. 1980. Vol. 2, P. 693-701.

  21. Gentile P., Broxmeyer H.E. // Blood. – 1983. – Vol. 61, N 5. – P. 982-993.

  22. Goldsmith S.J., Eitenmiller R.R., Barnhart H.M., Toledo R.T. & Rao V.N. Unsaturated iron-binding capacity of human milk. // J. Fd. Sci. 1982. Vol. 47, P. 1298-1304.

  23. Gutteidge I.M.C., Paterson S.K., Segal A.W., Halliwell B. // Biochem. J. – 1981. – Vol. 199. – P. 259-261.

  24. Harte J., Figarella C., Fossot Ch. et al. // Path. Biol. – 1984. – Vol. 32, N 4. – P. 239-244.

  25. Heierd W.C., Schwarz S.M., & Hansen I.H. Colostrum-induced enteric mucosal growth in beagle puppies. // Pediatr. 1984. Res. 18, P. 512-515.

  26. Johansson B. // Acta Chem. Scand. – 1960. – Vol. 14. – p. 510-512.

  27. Leffel M.S. & Spitznagel J.K. Fate of human lactoferrin and myeloperoxidase in phagocytosing human heutophils: effects of immunoglobulin G subslasses and immune complexes coated on latex beads. // infect. Immunol. 1975. Vol. 12, P. 813-820.

  28. Lima M.F., Kierszenbaum F. // J. Immunol. – 1987. – Vol. 139, N 5. – P. 566-571.

  29. Lonnerdal B. Iron in Breast milk. In iron nutrition in infancy and childhood, ed. A. Stekel. // Vol. 4, P. 95-118. Nestle Nutrition Workshop Series. New York: Vevey/Raven Press. 1984.

  30. Loughlin K.R., Gittes R.F., Partritge D., Stelos P. // Cancer (Philad.). – 1987. – Vol. 59. – P.566-571.

  31. Lu Y., Roe J.A., Gralla E.B., Valentine J.S. Metalloprotein ligand redesign: characterization of cooper-cysteinate proteins derived from yeast copper-zinc superoxide dismutase. // Chapman & Hall, New York; P. 64-77.

  32. Maalen H., Sheppard K. & Fletcher J. The discharge of primary and secondary granules during immune phagocytosis by normal and chronic granulocytic leukaemia polymorphonuclear neutrophils. // Br. J. Haematol. Vol. 51, P. 201-208.

  33. Malmoquist J., Hansen N.E., Karle S.H. // Scand J. Haemat. – 1978. – Vol. 21, N 1. – P. 5-8.

  34. Masson P.L. & Heremans J.F. Lactoferrin in milk from different species. // Comp. Biochem. Physiol. 1971. Vol. 39B, P. 119-129.

  35. Masson P.L. La lactoferrin. Proteine des secretions externes et des leukocyte neutrophiles. Bruxelles, 1970. P. 232.

  36. Masson P.L. La Lactoferrine. Proteine des secretion externes et des leucocytes neutrophiles. // Edition Arsci S.A., Bruxelles. 1970.

  37. Masson P.L., Heremans J.F., Dive C. // Clin. Chim. Acta. – 1966. Vol. 14. – P. 735-738.

  38. Masson P.L., Heremans J.F., Schonne E. // J. Exp. Med. – 1969. – Vol. 130. – P. 643-658.

  39. Masson P.L., Heremans J.F., Schonne E. Lactoferrin, an iron-binding protein in neutrophilic leukocytes// J.Exp. Med. (USA). 1969. Vol. 130, N 3. P. 643-658.

  40. Metz-Boutigue M.N., Jolles J., Mazurier J.et al. Human lactoferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrin// Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 145, N 3. P. 659-676.

  41. Miyauchi J., Watanabe Y. // Cell Tiss. Res. – 1987. – Vol. 247. – P. 249-258.

  42. Multigner L., Figarella C., Sahel H. et al. // Dig.,Dis. Sci. – 1980. – Vol. 25, N 3. – P. 173-178.

  43. Nichols B.L., McKee K.S. & Heubert H.A. Iron is not required in the lactoferrin stimulation of thymidine incorporation into the DNA of rat crypt enterocytes. // Pediatr. 1990. Res. 27. P. 525-528.

  44. Oram J.D., Reiter B. Inhibition of bacteria by lactoferrin and other iron-chelating agents//Biochim. et Biophys. Acta. 1968. Vol. 170, N 3. P 351-365.

  45. Pierce A., Colavizza D., Bennassa M., et al. Molecular cloning and sequence analysis of bovine lactotransferrin// Eur.J. Biochem. 1991. Vol. 196. P. 177-184.

  46. Rainard P. Bacteriostatic activity of bovine milk lactoferrin against mastitic bacteria. // Vet. Microbiol. 1986. Vol. 11, P. 387-392.

  47. Schmidt J.A., Abdulla E. // Lymphokine Res. – 1988. – Vol. 7. N 3. – P. 262-268.

  48. Sorensen M., Sorensen J.P.L. The proteins in whey//C. R. Trav. Lab. Carlsberg. 1939. Vol. 23, N 1. P.55-99.

  49. Van Snick I.L., Masrkowetz B., Masson P. // Ibid. – 1977. – Vol. 146. – P. 817-827.

  50. Van Snick I.L., Masson P., Heremans J. // J. Exp. Med. – 1974. – Vol. 140, N 4. – P. 1068-1084.

  51. Widdowson E.M. Development of the digestive system: comparative animal studies. // Am. J. Clin. Nutr. 1985. Vol. 41. P. 384-390.

  52. Yuan Hui Zhen, Maacks S., Granam W.W. // J. Bioluminesc. Chemilumines. – 1988. – Vol. 2, N 4. – P. 278-284.

  53. Айсен П.// Неорганическая биохимия. – М., 1978. – Т.1. – С. 333-360.

  54. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. – СПб.: Наука, 1999. – 162 с.

  55. Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Слепкова С.В. и др. // Биохимия. – 1988. Т. 53, № 11. – С. 1837-1843.

  56. Кокряков В.Р., Пигаревский В.Е., Алешина Г.М., Шамова О.В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при фагоцитозе//Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций/Сб. науч. Трудов под ред. А.Н. Маянского. Горький, 1989. С. 98-103.

  57. Немцова Е.Р., Якубовкая Р.И., Уткин М.М. // Вопр. Мед. Химии. – 1988. - №3. – С. 127-131.

  58. Николаев АА., Аншакова Н.И. // Вопр. Мед. Химии. – 1985. - №3. – С. 128- 131.

  59. Сухарев А.Е. Николаев А.А., Терехов С.М., Хайрулин Ю.Х. // Мед. Реф. Журн. XXI. – 1989. - №3 – Публ. 495.

  60. Сухарев А.Е., Николаев АА, Васильев Ю.М. и др. // Мед. Реф. Журн. XVIII. – 1988. - №10. – Публ. 1157.
  61. Шубин М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. М., 1980. – С. 22-23.
  62. Якубовская Р.И., Немцова Е.Р., Коханова И.Д. и др. // Вопр. Мед. Химии. – 1986. №6. – С. 75-79.