Руководитель
Беляков Николай Алексеевич
академик РАМН

Актуальность темы. В течение последних 25 лет в мире развивается эпидемия, связанная с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). По данным Объединенной программы ООН по ВИЧ/СПИДу (ЮНЭЙДС) число заболевших достигло 36 миллионов человек. В России на 1 ноября 2010 года были зарегистрированы 575071 ВИЧ-инфицированных больных, из них 4956 детей в возрасте до 15 лет, при этом ежегодный прирост вновь инфицированных по Российской Федерации превышает 50 тысяч человек. В Санкт-Петербурге зарегистрировано около 40 тысяч ВИЧ-инфицированных людей с ежегодным приростом около 4-4,5 тысяч и числом смертей у этой категории больных от 500 до 1000 случаев.

После инфицирования вирусом иммунодефицита человека развивается сложный комплекс патологических изменений в иммунной системе и органах, имеющих специфические рецепторы к CD4. В число этих органов входит и центральная нервная система, включая астроциты и нейроглию головного мозга.
В этой связи у значительной части больных развиваются выраженные нарушения функции нервной системы, которые могут приводить к потере профессиональных навыков и к инвалидизации. До настоящего времени неясен патогенез поражения головного мозга, не разработаны алгоритмы ранней диагностики этих осложнений, которые чаще манифестируют на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, либо при присоединении оппортунистических заболеваний.

Актуальность исследования обусловлена тем, что около 30% ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих или не получающих терапию, страдают от психических нарушений и неврологических заболеваний. Риск развития этих неврологических расстройств, обусловленных ВИЧ, связан не только с поздними стадиями инфекции, но с ранними изменениями в ЦНС, имеющими сложный генез не только инфекционной природы. Эти ранние отклонения в восприятии собственного заболевания и окружающего мира, наслаивающиеся на неврологические и инфекционные процессы в организме, существенно влияют на приверженность больных к диспансеризации, а в дальнейшем и к антиретровирусной терапии. В России в течение нескольких лет отмечается недостаточная приверженность к контролю за собственным здоровьем и число больных, избегающих посещения лечебных учреждений, составляет 20-30%. Даже после начала антиретровирусной терапии примерно у 25% ВИЧ-инфицированных больных развиваются когнитивные расстройства, имеется высокий риск развития оппортунистических инфекций и вторичных заболеваний с поражением ЦНС, приводящих больных к инвалидизации.

Общая цель исследования: изучение характера, особенностей, тяжести поражений ЦНС при ВИЧ-инфекции с целью ранней диагностики и оптимизации комплексного лечения, включая антиретровирусную терапию.

Задачи исследования:
1. Исследовать частоту и виды поражений ЦНС у больных с ВИЧ-инфекцией на разных стадиях заболевания.
2. Оценить динамику нарушений различных функций мозга посредством функциональных и электрофизиологических методов исследования.
3. Изучить особенности проявлений поражений головного мозга на разных этапах ВИЧ-инфекции, включая присоединение вторичных инфекций и заболеваний.
4. Провести сравнительную оценку нарушений со стороны ЦНС у больных на фоне ВААРТ и без противовирусной терапии.
5. Разработать комплексные организационные модели, этапность диагностики и лечения поражений ЦНС у больных с ВИЧ-инфекцией, провести экономический анализ оказываемой помощи в условиях амбулатории и стационара.

Ранее в России не проводилось комплексных междисциплинарных исследований состояния центральной нервной системы у больных с ВИЧ-инфекцией, где бы помимо неврологов и психологов участвовали специалисты по функциональной диагностике, радиологии, морфологии и др. Проведение подобного комплекса работ крайне актуально и возможно организационно в Санкт-Петербурге с участием нескольких заинтересованных научно-исследовательских институтов, клиник и университетов, с которыми имеются принципиальные договоренности. Основной клинической и научной базой в исследовании может быть Санкт-петербургский Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, который ведет учет и лечение всех больных с ВИЧ в Санкт-Петербурге. Это самый крупный и оснащенный Центр в России.

Для исследования неврологических нарушений у ВИЧ-инфицированных пациентов будут использованы современные методики: углубленное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование. Путем использования новых функциональных и электрофизиологических методов предполагается определять динамику нарушений когнитивной функции головного мозга, обусловленных ВИЧ, у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания.
Основными лучевыми исследованиями являются: модифицированные методы магнитно-резонансной томографии (МРТ) и компьютерной томографии (КТ) с использованием контрастных веществ, а также позиционно-эмиссионная томография (ПЭТ). Сопоставление данных лучевой диагностики с морфологическими исследованиями (структурными и ультраструктурными исследованиями тканей головного мозга) позволит дать точную оценку результатам высокотехнологичных методов исследования.

Одновременно с функциональными методами исследования планируется проведение психологического, а при необходимости – психиатрического тестирование больных с оценкой когнитивных функций на различных стадиях заболевания. С целью дифференциальной диагностики поражений головного мозга будет осуществлено комплексное сопоставление различных диагностических методов для разграничения первичных и вторичных процессов, протекающих в ЦНС на разных этапах ВИЧ-инфекции.
Проведение исследований позволит использовать разработанный диагностический алгоритм для оценки и прогнозирования функциональных и морфологических изменений головного мозга при развитии ВИЧ-инфекции, включая начальные стадии ВИЧ-инфекции. В процессе исследования планируется получить научно-практическую информацию, которая после обработки будет использоваться в практической медицине.

в начало страницы

Изучение влияния токсичности криопротекторов на половые клетки человека
при использовании различных протоколов криоконсервации

В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению проблем криобиологии. Криобиология прочно заняла свое место во многих направлениях биологии, биофизики, биохимии и медицины ХХI века. Основу криобиологии составляют процессы охлаждения живых систем.

Существуют два типа охлаждения: медленное замораживание и быстрое — витрификация. Медленное замораживание проходит при постепенном понижении температуры (2°С /мин) до -196°С (температура жидкого азота), при которой отсутствует биохимическая активность. Именно при такой температуре в жидком азоте хранятся биологические объекты многие годы. Для медленном замораживании кристаллизация во внешней среде происходит раньше, чем внутри клетки. Это связано с тем, что в цитоплазме клетки присутствует большое количество компонентов, замедляющих кристаллообразование (сахара, белки, нуклеозид-содержащие вещества). Кристаллизация внешней среды ведет к увеличению ее осмомолярности.

Вследствие повышения осмомолярности клетка отдает воду до тех пор, пока осмомолярность не выровняется. Таким образом происходит обезвоживание клеток, или дегидротация. Негативным следствием дегидротации могут быть различные явления, приводящие к денатурации биологических молекул. Следует отметить, что при быстром охлаждении объекта, явление дегидротации клеток не наблюдается. Поэтому часто используют витрификацию, при которой скорость охлаждения больше 20 000°С/мин. Такая сверхскорость охлаждения объекта приводит к затвердеванию жидкости без кристаллизации и переходу ее в аморфное или стекловидное состояние. Однако и витрификация, и медленное замораживание без добавления криопротекторов приводит к необратимым структурно-функциональным повреждениям в клетках и тканях. Поэтому проблемами криобиологии являются разработка подходов и методов криозащиты биологических объектов при воздействии низких температур.

Общая цель исследований: определение токсического эффекта в ткани гонад человека после применения различных криопротекторов при криоконсервации.

Задачи исследований:
1. оценка повреждающего эффекта на ткань гонад в зависимости от протокола замораживания;
2. оценка токсического эффекта на ткань гонад в зависимости от использования 1,2-пропандиола или диметилсульфоксида в качестве криопротекторов;
3. оптимизация протокола криоконсервации половых клеток и тканей гонад человека;
4. оптимизация метода витрификации ооцитов.
Эпоха криоконсервации половых клеток человека насчитывает не более 60 лет, однако за это время были достигнуты значительные успехи. В конце 40-х годов прошлого века A. Smith и соавт. впервые успешно заморозили сперматозоиды человека при –80 °С с использованием глицерина в качестве криопротектора (Smith, 1961). В конце 1970-х годов стало возможным криоконсервировать ооциты животных. Данный прогресс в криобиологии был связан с использованием криопротекторов. Основной задачей криопротекторов является уменьшение повреждающего действия замораживания на биологические объекты.

Криопротекторы можно разделить на две основные категории: проникающие и непроникающие. К основным проникающим криопротекторам относят глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль и диметилсульфоксид (ДМСО). Среди непроникающих криопротекторов можно выделить две группы веществ: олигосахариды и высокомолекулярные соединения (декстран, альбумин, фиколл др.) Непроникающие криопротекторы не могут быть использованы самостоятельно, поэтому всегда являются дополнением к проникающим. Тем не менее, их присутствие может значительно повлиять на эффективность криоконсервации биологических объектов. Механизмом транспорта проникающих криопротекторов может служить как диффузия, так и активный и пассивный транспорт. Например, глицерин проникает в эмбрион ранних стадий дробления путем диффузии, а на стадии бластоцисты вместе с диффузией добавляется также транспорт его через специфические каналы семейства GLUT. Эти каналы появляются в эмбрионе при дифференцировке клеток трофобласта и обеспечивают транспорт глюкозы (Pantaleon, Kaye, 1998). Проникновение криопротекторов также зависит от типа клеток и от вида животного. Так, транспорт глицерина в эритроциты крысы происходит в 262 раза быстрее, чем в эритроциты овцы (Пушкарь, Белоус, 1975).

Однако все криопротекторы являются токсичными для клеточных структур. Очень серьезным является вопрос об оценке риска развития токсических процессов при использовании криопротекторов на ткани гонад. Основное внимание при изучении данной проблемы уделяют проникающим криопротекторам, т.к. считается что проникновение криопротектора потенциально более опасно для клетки (Fahy et al., 1990). Так, было показано, что высокие концентрации криопротекторов приводят к возникновению хромосомных аберраций, патологий мейоза и митоза, изменению синтетических процессов в системе ДНК-РНК-белок в гаметах человека (Петрушко, 2000; 2004). Следует подчеркнуть, что оценка риска применения криопротекторов при криоконсервации половых клеток и тканей гонад лежит вне методологии классической токсикологии. Клиническая токсикология рассматривает развитие токсического процесса, прежде всего на организменном уровне.

В нашем исследовании целью криоконсервации ткани гонад является сохранение ее у онкологических больных (перед проведением химио- и лучевой терапии) с последующей аутотрансплантацией этой ткани обратно в организм после выздоровления. Поэтому важно иметь ввиду не только влияние криопротекторов на ткань во время криоконсервации, но и выведение их из ткани после размораживания. При этом следует учитывать биотрансформацию токсиканта и возможный эффект его метаболитов на организм после аутотрансплантации размороженной ткани гонад. Так, известно, что токсикант может специфически поражать определенную ткань, что в целом приводит к заболеванию всего организма. Например, этиленгликоль попадая в организм, проходит биотрансформацию в печени, а образующиеся метаболиты поражают прежде всего почки (Куценко, 2002).

Таким образом усовершенствование методов криоконсервации и размораживания дает широкие возможности для применения полученных результатов в научно-практической сфере.

в начало страницы