Этапы исследования
Физико-химические свойства и структура
Ионы меди в составе молекулы и строение активного центра
Организация и экспрессия гена
Метаболизм меди
Метаболизм железа
Ферментативная активность: антиоксидант и прооксидант
Церулоплазмин в центральной нервной системе
Регуляция уровня биогенных аминов
Ингибирование NO-зависимого клеточного ответа
Белок-белковые комплексы
Филогения и свойства медьсодержащих белков
Гомологи церулоплазмина
Наследственные заболевания
Диагностическое и фармакологическое применение
Список литературы

В 1944 году церулоплазмин (ЦП) был впервые описан шведскими учеными Холмбергом и Лауреллом [Holmberg, 1944], и подробно охарактеризован спустя несколько лет. Тогда же он получил свое название, означающее “небесно-голубой белок плазмы” [Holmberg & Laurell, 1948; Holmberg & Laurell, 1951]. После того, как была подробно изучена способность ЦП окислять Fe²⁺ до Fe³⁺ и доказано физиологическое значение этой реакции [Osaki, 1966], белок получил также систематическое название согласно Международной Классификации Ферментов - “ферро-О₂-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1”. Часто используется более короткое название - ферроксидаза.

ЦП — медьсодержащий гликопротеид, относящийся к a ₂-глобулиновой фракции плазмы крови млекопитающих. В состав молекулы ЦП входит по различным данным 6-7 ионов меди [Mukhopadhyay et al., 1997; Lindley, 1997]. Тот факт, что большая часть меди в сыворотке крови здорового человека, до 95%, входит в состав ЦП [Magdoff-Fairchild et al., 1969], кажется убедительным аргументом в пользу предположения о способности этого белка транспортировать медь.

В настоящее время установлено, что ЦП человека состоит из одной полипептидной цепи [Ryden, 1971]. Ее длина, как показало определение первичной структуры белка, составляет 1046 амк.о. При хроматографии на гидроксилапатите разделяются две изоформы ЦП [Broman, 1958]. Четыре олигосахаридные цепи присутствуют в преобладающей изоформе ЦП I типа и три в изоформе ЦП II типа. Олигосахаридные цепи соединены с белковой цепью N-гликозидной связью с остатками аспарагина в 179, 339 (нет в изоформе II), 378 и 743 позиции [Takahashi, 1984].

Молекулярная масса суммы амк.о. – 120,09 кДа; молекулы в целом составляет ~ 132 кДа (с учетом углеводных цепей и ионов меди), по данным исследования кристаллов ЦП ~ 132± 4 кДа [Magdoff-Fairchild et al., 1969].

Препараты ЦП различных видов млекопитающих имеют несущественные отличия по олигосахаридному составу и по первичной структуре, т.е. ЦП является консервативным белком. Однако, ЦП человека и быка различным образом гидролизуются при ограниченном протеолизе трипсином [Boivin et al., 2001], а ЦП крысы [Ryan et al., 1992] и дельфина [Bonaccorsi di Patti et al., 1992; Calabrese et al., 1997; Захарова и др., 2002] устойчивее к протеолитической атаке по сравнению с ЦП человека.

Полипептидная цепь ЦП легко фрагментируется в реакции ограниченного протеолиза [Ryden, 1971; Sang, 1995], причем ее разрыв происходит всегда по определенным пептидным связям, что приводит к образованию одних и тех же фрагментов. С помощью сайт-направленного мутагенеза был получен ЦП человека, не подвергавшийся протеолизу [Bielli, 2001]. В результате замены K 887 был исключен протеолиз с образованием при SDS-ЭФ в ПААГ 110 и 19 кДа фрагментов. Замена по R 481 исключила дальнейший протеолиз 110 кДа-фрагмента на 67 и 52 кДа фрагменты, и, наконец, замена по R 701 исключила дальнейший протеолиз 52 кДа-фрагмента на 28 и 25 кДа фрагменты.

Ниже приведена схема протеолитического расщепления молекулы ЦП на фрагменты [Ortel et al., 1984]:

Молекула ЦП включает три гомологичных домена, каждый из которых, в свою очередь, состоит из двух субдоменов.

Ионы меди, входящие в состав белков, исходя из их спектральных свойств, разделяют на три группы. Спектральные характеристики ионов Cu⁺² II типа, входящих в состав белков, близки к таковым у низкомолекулярных комплексов меди, имеющих бледно-голубое окрашивание, благодаря d-d переходам в области 600-800 нм спектра поглощения Cu⁺². После получения четкого сигнала ЭПР стало ясно, что в роли лигандов иона меди II типа в белках выступают четыре атома азота имидазольных колец His [Dawson et al., 1979]. В пользу имидазольного лигандирования Cu⁺² II типа говорят и результаты исследований этого иона методом спинового эха [Mondovi et al., 1977].

В отличие от Cu⁺² II типа, ионы меди III типа имеют ряд специфических спектральных характеристик, что вызвано особенностями их лигандирования. Эти ионы существуют в виде пар, расстояние между ионами обычно находится в пределах 0.34-0.45 нм [Brown et al., 1980], так что неспаренные электроны внешнего уровня имеют взаимно компенсированные спины. Поэтому в своем обычном состоянии Cu⁺² III типа не дают вклада в спектр ЭПР, они имеют характерную полосу с максимумом поглощения при 330-340 нм [Beltramini et al., 1990]. Как и Cu⁺² II типа, ионы меди III типа лигандируются атомами азота имидазолов His. Для образования центра связывания ионов меди III типа белковая глобула должна иметь своеобразный гистидиновый кластер, в котором неоднократно встречается последовательность His-X-His [Messerschmidt & Huber, 1990].

Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в области около 600 нм (максимум поглощения ЦП находится при 610 нм), в результате белки, их содержащие, приобретают интенсивную голубую окраску. Ион меди I типа имеет в качестве обязательных лигандов два атома азота имидазолов His и атом серы Cys. Как правило, в качестве четвертого лиганда выступает еще один атом серы Met. Весь центр связывания Cu⁺² I типа имеет форму неправильного тетраэдра, что, вероятно, является компромиссом между формой полноценного тетраэдра, характерной для Cu⁺, и квадратно-плоскостной координацией Cu⁺² в составе низкомолекулярных комплексов меди или неголубых медьпротеидов [Lu et al., 1993]. Скорее всего, требуя наименьших энергетических затрат на реорганизацию центра, такая форма обеспечивает необычайно быстрые переходы иона меди I типа из одного состояния окисления в другое и обратно, что, в свою очередь, дает голубым белкам возможность эффективно участвовать в реакциях переноса электронов.

В состав активного центра ЦП входят ионы меди всех трех типов. Согласно данным кристаллографических исследований, молекула ЦП содержит 6 прочно связанных ионов меди [Lindley, 1997]. Три из них - ионы “голубой” меди, один – Cu⁺² II типа, оставшиеся два составляют диамагнитный центр III типа. Ионы меди III типа обеспечивают сохранение стабильной структуры молекулы ЦП [Vachette et al., 2002].

За низкоаффинное связывание 7-го иона меди, экспонированного на молекуле ЦП ответственен H426 [Mukhopadhyay et al., 1997], этому иону приписывают прооксидантные свойства.

Ген протяженностью в 65 kb, кодирующий ЦП, локализован на хромосоме 3 (q23-q24) и содержит 20 экзонов [Daimon et al., 1995]. Анализ 5`-фланкирующего региона гена ЦП крысы показал наличие TATAAA (-30 bp) и AACCAATCT (-102 bp) сайтов, а также выявил сайты, гомологичные сайту альбумина D [Fleming and Gitlin, 1992]. В гепатоцитах в результате альтернативного сплайсинга образуется два вида иРНК протяженностью в 4.2 и 3.7 kb, первая из которых содержит длинный полиаденилированный конец в 3'-нетранслируемой области, выполняющий регуляторную роль [Yang et al., 1986]. Концентрация ЦП в крови повышается во время воспаления, инфекции и продолжительных травматических состояний в результате активации транскрипции гена ЦП индуцированной g -интерфероном [Sampath et al., 2003] и цитокинами [Gitlin, 1988]. При дефиците железа происходит активация транскрипции гена ЦП гипоксия-индуцибельным фактором 1 (HIF-1), который также активирует гены эритропоэтина, оксигеназы-1 гема, трансферрина и его рецептора [Mukhopadhyay et al., 2000]. Синтез ЦП регулируется на уровне иРНК белковым фактором, связывающимся с полиаденилированным концом, и эукариотическим фактором инициации транскрипции 4G [Mazumder et al., 2001]. На мембране клеток ЦНС (астроцитов, лептоминингеальных клеток) и клетках Сертоли, в результате альтернативного сплайсинга между 19 и 20 экзонами, находится ЦП с GPI-якорем на С-конце. Это, вероятно, связано с необходимостью осуществления функций присущих ЦП в районах, отграниченных от поступления ЦП крови гематоэнцефалическим и гематотестикулярным барьерами [Patel et al., 2000; Mittal et al., 2003; Fornta et al., 1999]. Экспрессия ЦП в ЦНС продемонстрирована в основных структурах мозга, в т.ч. сетчатке глаза [Klomp et al., 1996; Klomp & Gitlin, 1996]. В эндоплазматическом ретикулуме происходит N-гликозилирование ЦП по остаткам аспарагина. Встраивание в ЦП ионов меди, вероятно, происходит в транс-сети аппарата Гольджи. Рецепторы для ЦП выявлены на клетках аорты и сердца цыплят [Stevens et al., 1984], эритроцитах [Barnes & Friden, 1984], моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах [Kataoka & Tavassoli, 1985], эндотелии печени и клетках Купффера [Kataoka & Tavassoli, 1984], а также яйцеклетках [Orena et al., 1986].

Уже довольно давно было высказано предположение о способности ЦП транспортировать в организме медь [Broman, 1967]. В пользу этого говорит тот факт, что большая доля ионов меди в плазме крови входит в состав ЦП [Magdoff-Fairchild et al., 1969]. Последующие наблюдения поставили под сомнение справедливость этой гипотезы. До недавнего времени считалось, что за исключением доставки меди, поступающей в русло крови и печень (при котором медь связана с альбумином и с некоторыми низкомолекулярными соединениями) весь транспорт меди – между печенью и другими органами – осуществляется ЦП [Marceau & Aspin, 1972]. Однако, исследования на мышах с ацерулоплазминемией и применением ⁶⁴Cu меток показали, что ЦП не играет критической роли ни при абсорбции, ни при экскреции меди организмом [Meyer et al., 2001]. И все же ЦП маркирует нарушения обмена меди, а ниже будет рассмотрена взаимосвязь метаболизма меди и железа посредством ЦП.

После поглощения ионов меди энтероцитами и поступления в кровяное русло, медь, находясь в комплексах с белками плазмы, пептидами и аминокислотами, поступает в гепатоциты с помощью медного транспортера hCtr1, активность которого ингибируется ионами Cd²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ и Co²⁺. В цитоплазме гепатоцита медь распределяется между шаперонами (HCOX17, HAH1/Atox1, hCCS), которые распределяют медь по клеточным депо, расходующим ее по мере синтеза медьсодержащих белков. HAH1/Atox1 поставляет ионы меди АТФ-азе Р-типа (ATP7B, ген локализован на 13 хромосоме), находящейся в транс-сети аппарата Гольджи. ATP7B встраивает ионы меди в ЦП, обеспечивает их экскрецию вместе с желчью и везикулярный траспорт ионов меди. В цитоплазме ионы меди находятся в комплексе с глутатионом (GSH), который препятствует токсическому действию активных форм кислорода. Механизмы секреции меди с желчью еще не разъяснены до конца. Вероятно, секреция осуществляется двумя путями: везикулярный транспорт, который можно ингибировать с помощью колхицина, и опосредованный канальцевым транспортером органических анионов (сМОАТ) транспорт медного комплекса GSH [Fuentealba & Aburto, 2003].

Уже 70 лет назад впервые было отмечено, что при недостаточном поступлении меди в организм животные страдали анемией [Hart et al., 1928]. У подопытных животных, содержавшихся на медьдефицитной диете, через некоторое время наступало уменьшение концентрации сывороточного железа и меди эритроцитов, а затем резко снижалось количество эритроцитов в крови [Lahey et al., 1952].

Обнаружение ферроксидазной активности ЦП позволило предположить, что этот фермент является связующим звеном между обменом железа и меди. Среди всех субстратов ЦП минимальное значение K_m ~ 0.65 mkM найдено для Fe²⁺ [Osaki, 1966]. Было показано, что измерение скорости встраивания Fe³⁺ в апо-ТФ может быть использовано для количественной оценки оксидазной активности ЦП. Кроме того, при использовании Fe²⁺ в сыворотке крови человека при рН=7.4 формируется Fe³⁺-ТФ, однако, без участия ЦП за сутки в ТФ встраивается 3-5 мг Fe³⁺ против 60 мг в присутствии ЦП [Frieden & Hsieh, 1976]. Учитывая суточную потребность в железе для человека (35-40 мг), можно сделать вывод, что ЦП необходим для поддержания нормального уровня окисленного железа в плазме крови.

Железо, присутствующее в пищевых продуктах в закисной (Fe²⁺) и окисной (Fe³⁺) формах, для поглощения мембраной энтероцита должно восстановиться до Fe²⁺ [Зайчик и Чурилов, 2001]. В щеточной каемке энтероцита присутствует апикальная мембранная редуктаза (FeR) и связанный с ней транспортер двухвалентных металлов DMT1 (Nramp2, DCT1, SLC11A2), которые осуществляют абсорбцию железа в тонком кишечнике. На базолатеральной мембране энтероцита присутствует другой транспортер железа - IREG1 (MTP1, ферропортин 1, SLC11A3), способствующий переносу Fe²⁺, которое затем окисляется гомологом ЦП – гефестином, встроенным в мембрану. Мутация в гене IREG1 (локализация - 2q32) ведет к гемохроматозу [Roy & Andrews, 2001].

Гефестин (локализация - Xq11-q12) принадлежит вместе с ЦП к одному суперсемейству белков. Структура гефестина (1158 амк.о.), смоделированная по третичной структуре ЦП и данным о последовательности кДНК, содержит гомологичный ЦП активный центр и участки связывания меди [Syed et al., 2002]. В отличие от ЦП, в молекуле гефестина один из доменов является трансмембранным [Anderson et al., 2002]. У мышей сцепленная с полом мутация в гене гефестина (sla) приводит к дефициту железа и анемии. Эксперименты на мышах с мутациями белков абсорбции железа и мышах дикого типа, содержавшихся на железодефицитной диете, показали, что DMT1 модулирует ответ на местные сигналы содержания железа, тогда как экспрессия генов IREG1 и гефестина увеличивается в ответ на системные изменения уровня железа [Chen et al., 2003]. Таким образом, потребность организма в железе в первую очередь отражается на апикальных белках энтероцита, а затем детерминирует экспрессию белков базолатеральной мембраны. Содержание железа в цитоплазме энтероцита контролирует активность транспортера DMT1 [Anderson et al., 2002]. Эксперименты по передаче микроэлементов плоду от матери, находившейся на железо- и медьдефицитной диете показали, что материнский организм минимизирует дефицит за счет увеличения экспрессии рецептора трансферрина, гефестина, а также увеличения содержания меди в печени, сыворотке и плаценте матери [Gambling et al., 2003]. У крыс, содержавшихся на железодефицитной диете, показано увеличение иРНК гефестина [Sakakibara and Aoyama, 2002].

Плацентарная медьсодержащая оксидаза (ПМСО) была изучена на культуре клеток BeWo плацентарного трофобласта человека, используемой как модель транспорта железа и меди. Подобно гефестину, ПМСО является мембраносвязанными 140 кДа-белком, обладающим ПФД-оксидазной активностью и реагирующим с антителами к ЦП. ПМСО является критическим звеном в обмене железа и меди клетками плаценты [Danzeisen et al., 2002].

GPI-заякоренный ЦП астроцитов физически связан с транспортером дивалентных металлов - IREG1, который не способен в отсутствии ЦП транспортировать железо из астроцита. Другой транспортер Fe²⁺ - DMT1 в нервной ткани опосредует отток железа в глиальные клетки от астроцитов [Jeong & David, 2003].

Подтверждением тесной зависимости обмена железа от ЦП у человека является ацерулоплазминемия, заболевание вызванное мутацией в гене ЦП, приводящей к утрате ферментативной активности ЦП. При этой мутации резко снижена оксидазная активность белка, что вызывает гемосидероз с обширными отложениями железа в тканях различных органов [Yoshida et al., 1995].

Некоторые ионы тяжелых металлов вызывают снижение активности ЦП в сыворотке крови. Эффективность этих ионов в порядке убывания следующая: Ag⁺>Cd²⁺>Mo⁶⁺>Zn²⁺ [Whanger & Weswig, 1970].

Из приведенных выше примеров видно, что ЦП занимает связующую позицию в метаболизме меди и железа - двух важнейших микроэлементов в организме млекопитающих.

В конце 70-х годов появились первые сообщения о способности ЦП играть роль “чистильщика” супероксидных анион-радикалов (О₂· ) [Goldstein et al., 1979]. При этом действие фермента, как выяснилось, не зависит от его взаимодействия с веществами, предварительно восстановленными О₂· , а, скорее, от взаимодействия с самим О₂· , которое сходно по ряду параметров с действием супероксиддисмутазы. Позже J.Bannister и соавторы [Bannister et al., 1980] сделали вывод, что они наблюдали в экспериментах обычную реакцию окисления О₂ · ферментом-оксидазой (ЦП), описываемую следующим уравнением:

тогда как реакция истинного дисмутирования, катализируемая супероксиддисмутазой, отличается тем, что место кислорода в ней занимает О₂· , и уравнение принимает следующий вид:

Также ЦП препятствует накоплению и действию токсических окисляющих радикалов в плазме крови за счет ферроксидазной активности:

Катализируя окисление Fe²⁺ до Fe³⁺, фермент поддерживает соотношение Fe²⁺:О₂ равным 4:1, обеспечивая четырехэлектронный перенос на О₂ с образованной воды и предотвращая неферментативную реакцию, в результате которой образуется О₂·:

Окисляя Fe²⁺ до Fe³⁺ ЦП может препятствовать реакции Фентона: образования OH· радикалов при взаимодействии Fe²⁺ c H₂O₂,:

С помощью сайт-направленного мутагенеза для ферроксидазной реакции доказана важность амк.о.: E633, E567, H602, E935 и H940 [Brown et al., 2002].

Способствуя встраиванию в ферритин окисленного Fe³⁺, ЦП ингибирует супероксидное и ферритин-зависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ) [Samokyszyn et al., 1989]. Описанные выше свойства ЦП послужили основой для объяснения его противовоспалительной активности, что вместе с быстрым возрастанием концентрации ЦП (в 2-3 раза) в русле крови уже в начале воспалительной реакции позволяет причислить его к белкам “острой фазы” [Whanger & Weswig, 1970]. Показано, что ЦП может выступать как фактор роста, вследствие антиоксидантных свойств [Alcain et al., 1991].

Пептиды - карнозин, гомокарнозил и ансерин способны препятствовать свободно-радикальному образованию дитирозиновых сшивок в ЦП [Kang et al., 2002]. Эти пептиды также препятствуют образованию под действием системы ЦП/H₂O₂ агрегатов a-синуклеина, ключевого компонента телец Леви патогномонических для болезни Паркинсона [Kim et al., 2002]. В присутствии гомоцистеина ЦП способен ускорять окисление липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) за счет восстановления ионов Cu²⁺ в ЦП до Сu⁺ [Exner et al., 2002]. Альдегидная группа глюкозы также способна усилить действие ЦП в процессе окисления ЛПНП [Leoni et al., 2002]. Окисление ЛПНП зависит также от интактности молекулы ЦП и количества ионов меди, связанных с ЦП [Mukhopadhyay et al., 1996]. С помощью сайт-направленного мутагенеза по замене лигандирующих медь His был определен участок молекулы в районе H426, ответственный за прооксидантные свойства ЦП [Mukhopadhyay et al., 1997].

In vivo было продемонстрировано защитное действие ЦП при действии на клетки HepG2 концентраций NO превышающих физиологические.

ЦП катализирует образование нитротиолов, при реакции GSH и NO происходит перенос электрона из NO с иона меди I типа на кластер ионов меди II и III типа с последующим четырехэлектронным переносом на кислород и образованием воды [Inoue et al., 1999].

GPI-форма ЦП сетчатки, вероятно, противостоит опосредованному квантами света окислительному стрессу и препятствует накоплению железа, которое приводит к помутнению сетчатки у больных с дефектом гена ЦП. Поскольку уровень ЦП-мРНК возрастает в 8 раз после освещения сетчатки, был выявлен во всех типах клеток сетчатки и превосходил количество ЦП, найденное в остальных структурах мозга [Chen et al., 2003].

Экспрессия гена ЦП в ЦНС была обнаружена в сетчатке и некоторых структурах мозга мыши и человека [Klomp et al., 1996; Klomp & Gitlin, 1996]. У больных ацерулоплазминемией наблюдаются осложнения, вызванные свободно-радикальными процессами и отложениями железа в тканях, в т.ч. в нервной, и, как следствие этого, нарушение функций ЦНС и помутнение сетчатки. Эти факты убеждают в значимости ЦП, как антиоксиданта и ключевого звена метаболизма железа в ЦНС. Действительно, нарушение системы GPI-заякоренный ЦП и IREG1 на мембране астроцита нарушает отток железа в глиальные клетки опосредованный DMT1 [Jeong & David, 2003]. Высказано предположение об антиоксидантном и детоксицирующем действии ЦП на цереброспинальную жидкость [Mittal et al., 2003].

С помощью техники patch-clamp на клетках нейробластомы была продемонстрирована способность ЦП осуществлять быструю деполяризацию мембраны. Термически денатурированный или лишенный меди ЦП не обладал этой способностью. Деполяризующий эффект ЦП опосредован ингибированием K⁺-каналов, а не увеличением притока Na⁺ или Ca²⁺ ионов [Wang et al., 1995]. Предварительная обработка сывороточной аминооксидазой быка ингибировала деполяризующее действие ЦП, кроме того, аминооксидаза активировала K⁺-каналы ингибированные ЦП [Wu et al., 1996]. Эксперименты на модели развития нервных клеток – линии Р 19 эмбриональной карциномы мыши, продемонстрировали действие ЦП на агрегацию нейронов вышедших в дифференцировку. Наблюдалась зависимость как от концентрации ЦП, так и от времени начала выхода клеток в дифференцировку. Другие медьсодержащие белки сыворотки, комплексы меди и денатурированный ЦП не обладали способностью вызывать агрегацию клеток. Было отмечено связывание меченного ЦП, очевидно посредством рецептора на поверхности молодых клеток, а также уменьшения этого взаимодействия со старением нейронов [Maltais et al., 2003].

В число субстратов, окисляемых ЦП, входят норадреналин, относящийся к катехоламиновым гормонам, и такой нейрогуморальный агент, как 5-гидрокситриптамин (серотонин) [Wallas et., 1964]. Молекулярный механизм, лежащий в основе катализа, до конца не ясен, но участие ЦП в метаболизме нейромедиаторов центрального действия чрезвычайно важно, тем более, что местом действия ЦП, вполне вероятно, является ЦНС, поскольку фермент поглощается из плазмы крови клетками мозга [Linder & Moor, 1977].

Как оказалось, синтетический диэтиламид D-лизергиновой кислоты (ЛСД), известный своим галлюциногенным действием, подавляет окисление серотонина, но ускоряет окисление норадреналина и дофамина в мозгу [Barchas & Freedman, 1963], и в концентрации, равной 10% от концентрации нейромедиатора, ЛСД угнетает катализируемое ЦП окисление серотонина в 2 раза, тогда как скорость окисления норадреналина увеличивается в 4 раза. Величины K_m для норадреналина и серотонина близки - 3 мкМ и 1 мкМ, соответственно. Вполне вероятно, что ЦП контролирует их соотношение в мозговых структурах, и тогда действие ЛСД на ЦНС объясняется нарушением баланса между ними.

Оксид азота (NO), помимо регуляции агрегации тромбоцитов, участия в нейромедиаторных процессах и других функций, участвует также в передаче сигнала от эндотелиальных клеток к гладкомышечным. В ответ на действие ацетилхолина, повышающего концентрацию ионов Ca²⁺, который активирует NO-синтетазу, из аргинина образуется NO и цитрулин. NO диффундирует в гладкомышечную клетку, где активируя гуанилатциклазу, вызывает мышечное расслабление, опосредованное активацией cGMP-протеинкиназы. Было продемонстрировано ингибируещее действие физиологических концентраций ЦП на расслабление аорты кролика [Cappelli-Bigazzi, 1997]. Действие ЦП и гистидинового медного комплекса, но не свободной меди, уменьшало уровень NO, цитрулина и cGMP, что свидетельствует об опосредованном ЦП ингибировании NO-синтетазы. Косвенно, это подтверждается данными об увеличении риска сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с повышенным уровнем меди сыворотки [Bianchini et al., 1999].

В 90-х годах в свете обнаружения белковых комплексов ЦП, стало возможно говорить о его новых функциях. В процессе свертывания крови, в результате протеолиза церулоплазминоподобные кофакторы F V и F VIII, активируются, и принимают конформацию, благоприятную для образования комплексов с протеазами F IXa и F Xa, активирующими F II и F X. Антикоагулянт, протеин С, в результате ограниченного протеолиза F Va и F VIIIa способен ингибировать протеолитический каскад свертывания крови. Находясь в конкурентных отношениях с факторами свертывания крови (ФСК) за связывание с протеином C, ЦП мог бы участвовать в регуляции коагуляции. Декапептид ЦП (¹⁰²⁸HAGMETTYTV¹⁰³⁷) разобщает комплекс ЦП с протеином С и снимает эффект 5-кратного увеличения активности ЦП в комплексе [Walker & Fay, 1990]. Однако, после сообщения о взаимодействии ЦП с протеином С, ряд гематологов поставили под сомнение гипотезу о способности усиливать коагуляцию ЦП in vivo, что было подтверждено исследованиями показателей гемостаза у здоровых людей и у пациентов с дефектами F V [De Visser et al., 2002]. Взаимодействуя с миелопероксидазой [Segelmark et al., 1997], ЦП ингибирует ее опасные прооксидантные свойства:

Вероятно, это имеет значение при чрезмерной активации кислородного взрыва в очаге воспаления и распространение его по руслу крови. Однако, взаимодействие с миелопероксидазой не влияет на оксидазные, на пероксидазные и иммунореактивные свойства ЦП [Park et al., 2000].

Группа Aust показала, что для полноценного встраивания Fe³⁺ в ферритин важны не только ферроксидазная активность ЦП, но также взаимодействие интактной молекулы ЦП с ферритином [Juan & Aust, 1998; Reilly et al., 1998; Van Eden & Aust, 2000].

Взаимодействие ЦП с нейропептидом PACAP 38 [Tams et al., 1999], возможно, играет определенную роль в нейрорегуляторных процессах, и особенно интересно в свете обнаружения мембраносвязанного ЦП в астроцитах, который участвует в регуляции уровня железа в ЦНС и предотвращении свободно-радикальных реакций [Patel & David, 1997; Patel et al., 2002]. Было продемонстрировано, что среди всех белков плазмы крови, именно ЦП связывается PACAP 38, кроме того, для этого взаимодействия достаточно С-концевого декапептида (29-38) [Tams et al., 1999].

Взаимодействие ЦП с ЛФ [Zakharova et al., 2000], бактерицидным белком нейтрофилов, молока и других секретов, интересно в свете бактерицидного действия ЦП в присутствии Fe²⁺ и фосфатов [Klebanoff, 1992]. В экспериметрах in vivo была показана циркуляция комплекса ЦП крысы – ЛФ человека в течение 5 часов после введения крысе 10 мг ЛФ [Zakharova et al., 2000]. Эксперименты in vitro указывают на возможность встривания ионов меди в ЛФ при протеолитической или окислительной деградации ЦП. Продемонстрирована электростатическая природа этого взаимодействия, а также увеличение аффинности комплекса при протеолизе ЦП [Pulina et al., 2002].

GPI-заякоренный ЦП астроцитов физически взаимодействует с IREG1 и способствует оттоку Fe³⁺ из астроцитов. Взаимодействие доказано с помощью коиммунопреципитации и колокализации на мембране астроцита при двойной метке флуоресцентными антителами к ЦП и IREG1 [Jeong and David, 2003].

Доменная организация ЦП позволяет выдвинуть гипотезу о его происхождении вследствие трипликации предкового гена, кодирующего примитивную оксидазу [Dwulet & Putnam, 1981]. Оксидазы других представителей живого мира во многом гомологичны ЦП, что говорит в пользу гипотезы происхождения медьсодержащих оксидаз от общего гена [Ohkawa et al., 1989; Ryden, 1988].

Суперсемейство купредоксинов включает следующих представителей: рустицианин, стеллацианин, амицианин, азурин, псевдоазурин, пластоцианин, медьсодержащая нитрит-редуктаза (К.Ф. 1.7.99.3), лакказа (К.Ф. 1.10.3.2), L-аскорбат оксидаза (К.Ф. 1.10.3.3), церулоплазмин (К.Ф. 1.16.3.1), цитохром С-оксидаза (полипептид II, К.Ф. 1.9.3.1), убихинон-оксидаза (полипептид II, К.Ф. 1.10.3.-). Это суперсемейство служит лучшим примером вариации содержания металлопростетических групп, в нем представлены все типы сайтов связывания ионов Cu. При этом степень гомологии не кореллирует с содержанием ионов Cu и электрон-транспортной функцией [Todd et al., 2001]. Поскольку детальное описание каждого из филогенетических родственников ЦП выходит за рамки рассматриваемой проблемы, в этом разделе будут очерчены лишь общие принципы организации и функционирования конкретных белков и их филогенетические связи.

Хотя медьсодержащие белки широко распространены как у прокариот, так и у эукариот, до недавнего времени ферменты, сходные с лакказой, были найдены только у эволюционно более продвинутых групп [Ryden and Hunt, 1993]. Как показал анализ выравнивания первичных последовательностей, совмещения трехмерных структур, и построение филогенетического древа, медьсодержащие оксидазы эволюционировали посредством дупликации и последовательной дивергенции от группы малых медьсодержащих электрон-транспортных белков. Самым ранним было расхождение пластоцианина и азурина, связанное с отделением фотосинтезирующих от остальных групп бактерий, что произошло около 3· 10⁹ лет назад. Азурин явился предком субъединицы цитохром С-оксидазы. Расхождение растений и животных, вероятно, произошло 1.4· 10⁹ лет назад и соответствовало разделению потомков пластоцианина ветви лакказы и аскорбат оксидазы от не триплицированного предка церулоплазмина. Церулоплазмин и церулоплазминоподобные ФСК F V и F VIII разошлись приблизительно 0.5-0.8· 10⁹ лет назад.

Гомология ЦП с ФСК F V и F VIII [Church et al., 1984; Pemberton et al., 1997] позволяет объединить их в одно суперсемейство белков. F VIII и F V [Mann et al., 1984] способны связывать ион Cu (I), который, вероятно, участвует в ассоциации тяжелой и легкой цепи F VIII [Tagliavacca et al., 1997]. Расположение дисульфидных мостиков в ЦП и F VIII, [Yang et al., 1986], также гомологично [McMullen et al., 1995], при 48% гомологии последовательностей.

Лакказа (бензендиол:О₂-оксидоредуктаза) содержит четыре атома Cu: 1 I типа (одноэлектронный перенос), 1 II типа (реокисление Cu I типа, стабилизация H₂O₂-интермедиата) и 2 III типа (четырехэлектронный перенос на O₂ с образованием H₂O) [Piontek et al., 2002]. Лакказы используют O₂ для окисления фенольных производных (пирогаллол, п-крезол, 2,6-димелитоксифенол), ароматических аминов, а также органических полимеров – лигнина и гумминовых кислот, посредством одноэлектронного переноса, сопровождающегося образованием свободных радикалов. Cпектральными методами в остановленной струе показано образование свободных радикалов в тринуклеарном центре за счет магнитного взаимодействия с ионом Cu III типа при неполном трехэлектронном переносе на O₂ [Huang et al., 1999]. Физиологические функции лакказ не изучены достаточно полно, однако показано их участие в развитии спор и миелинизации у грибов, в ответе на повреждения и образовании лигнина у высших растений, а также в разложении органических остатков деградацией лигнина и гумминовых кислот. В последнее десятилетие обнаружено большое количество лакказо-подобных белков у прокариот [Claus, 2003]. Генетический анализ указывает на их участие в пигментации клеток и процессах окисления металлов.

Аскорбат оксидаза (L-аскорбат:О₂-оксидоредуктаза) представляет собой 140 кДа-димер, составленный из мономеров, содержащих четыре атома Cu: 1 I типа, 1 II типа и 2 III типа. Тринуклеарный центр образован парой ионов Cu III типа и находящимся на расстоянии 1.23 нм ионом Cu II типа [Farver and Pecht, 1992]. Синтез аскорбат оксидазы индуцируется светом и растительными гормонами. Продемонстрировано влияние этого фермента на рост растений [Pignocchi et al., 2003].

Под гомологами в данном разделе подразумеваются не гефестин и ПМСО – медьпротеиды млекопитающих в высокой степени гомологичные ЦП, а медьсодержащие оксидазы микроорганизмов со сходными физиологическими функциями.

Одноклеточная водоросль Chlamydomonas reinhardtii экспрессирует 150 кДа-белок в условиях дефицита железа. Анализ нуклеотидной последовательности кДНК выявил сходство этого белка с гефестином, показал наличие трансмембранного домена и двух мотивов, характерных для медьсодержащих оксидаз, что предполагает ферроксидазную активность данного белка [Herbik et al., 2002].

Для модельных объектов Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Candida albicans, представителей царства грибов, найдены медьсодержащие оксидазы Fet3p, fio1⁺ и CaFet3p, ассоциированные с трансмембранными пермеазами железа Ftr1p, fip1⁺ и CaFtr1p, соответственно [Askwith and Kaplan, 1997; Hasset et al., 1998; Eck et al., 1999]. Среди этих оксидаз наиболее изучен Fet3p: с помощью сайт-направленного мутагенеза показаны критические для ферментативной активности амк.о. H489 и L494, гомологичные таковым у ЦП [Askwith and Kaplan, 1998]. Эксперименты с мутантными штаммами дрожжей Dfet3 показали, что экспрессия в них гефестина восстанавливает рост клеток на железодефицитной среде, а также продемонстрировали зависимость активности оксидазы от медьтранспортирующих белков ССС2 и GEF1 [Li et al., 2003].

Попытки найти ген лакказы у бледно-розового базидиомицета Phanerochaete chrysosporium привели к идентификации 75 кДа-белка MCO1. MCO1 окисляет разнообразные субстраты, включая ароматические амины, однако эти фенольные производные являются худшими субстратами, чем Fe²⁺ для которого найдено наименьшее значение K_m около 2 mkM. Таким образом, геном данного базидиомицета экспрессирует вместо типичной лакказы уникальную внеклеточную ферроксидазу MCO1, а для разрушения растительных остатков такие ферменты, как лигнин пероксидазу, пероксидазу марганца и глиоксаль пероксидазу [Larrondo et al., 2003].

Наиболее частым наследственным заболеванием (1/30 000), при котором наблюдается уменьшение количества ЦП, является гепатолентикулярная дегенерация, также называемая болезнью Вильсона-Коновалова. Заболевание было впервые описано в 1912 году А.К. Вильсоном, в нашей стране - Н.А. Коноваловым.

При данной болезни в печени наблюдается аутосомно-рецессивный дефект гена WND, продукт которого отвечает за экскрецию меди с желчью. Удобной моделью болезни Вильсона-Коновалова на грызунах являются крысы линии Long-Evans Cinnamon [Yamada et al., 1993]. Уровень холо-ЦП после введение этим животным аденовируса с геном WND (ATP7B) восстанавливается, при этом ATP7B локализуется в аппарате Гольджи [Terada et al., 1998].

Здоровые доношенные дети рождаются с низкой концентрацией ЦП в крови и запасами меди, сосредоточенными в печени. В течение первых месяцев концентрация ЦП в плазме растет и происходит перераспределение меди в организме. При болезни Вильсона-Коновалова этот процесс нарушен, и уровень сывороточного ЦП остается низким. Устанавливается положительный медный баланс, экскреция меди, поступающей в организм, затруднена. Гепатоциты подвергаются токсическому действию меди, развивается их жировое перерождение, формируется фиброз и цирроз печени. При разрушении гепатоцитов, медь эпизодически высвобождается из печени и откладывается в других органах и тканях, что обуславливает приступы гемолитической анемии и разнообразные, в основном, моторные, неврологические нарушения, связанные с отложением меди в ЦНС. В десцеметовой мембране лимба роговицы появляются патогномонические для данного заболевания золотисто-коричневые или зеленоватые кольца Кайзера-Флейшера. Это может сопровождаться катарактой, артритами, холелитиазом и уролитиазом, синдромом Фанкони. Часто сопровождается гиперхолестеринемией и инсулинорезистентностью. Избыток меди в стенках сосудов способствует развитию атеросклероза [Зайчик и Чурилов, 2001]. Нередко болезнь Вильсона-Коновалова сопровождается развитием болезни Паркинсона [Johnson, 2001].

При болезни Менкеса (или "курчавости волос") происходит еще более сложное нарушение обмена меди, сцепленного с X-хромосомой рецессивного характера. Дефицит меди возникает в печени, мозге, сосудах и сыворотке крови. При этом в кишечнике, почках и фибробластах кожи ее содержание нормально или повышено. Снижено количество ЦП и имеется дефицит активности тканевых аминооксидаз. Нарушается образование перекрестных связей в коллагене и эластине. Развивается картина, похожая на экспериментальный дефицит меди у животных, но без признаков анемии. Доминирует нарушение стабильности соединительно-тканных структур. Это выражается в аневризмах, эмфиземе, остеопорозе, иногда следует разрыв сердца. Волосы больных имеют курчавый вид [Зайчик и Чурилов, 2001].

В настоящее время известно более десятка моделей нарушений метаболизма меди у животных: вышупомянутые крысы линии LEC и мыши с токсичным молоком, Bedlington и West Highland белые террьеры, овцы North Ronaldsay, примененные для изучения индийского детского цирроза печени, доберманы пинчеры и Skye террьеры с хроническим гепатитом, сходным с первичным желчным циррозом у человека, далматинцы с повышенной активностью сывороточных аланин- и аспартат аминотрансфераз и сиамские коты с токсическими отложениями меди в печени [Fuentealba & Aburto, 2003].

Ацерулоплазминемия - наследственное заболевание, обусловленное дефектами гена ЦП. Ацерулоплазминемия сопровождается диабетом, накоплением железа в различных тканях, в т.ч. в нервной ткани, что ведет к помутнению сетчатки, непреднамеренным движениям, слабоумию. В глиальной ткани увеличен уровень ПОЛ, в митохондриях комплексы I и IV дыхательной цепи теряют более половины ферментативной активности [Harris et al., 1995; Miyajima et al., 2002]. Астроциты у таких больных деформированы, вплоть до шаровидной формы, накапливают маркер ПОЛ - 4-гидроксиноненал, а также глиальный фибриллярный кислый белок, белок S-100 и убиквитин, и похожи на астроциты 1 типа Альцгеймера [Kanaeko et al., 2002]. Мембраны эритроцитов содержат увеличенное количество длинноцепочечных жирных кислот - 17-цис-гексакозеновой (26:1) и гексакозановой (26:0), вероятно, вследствие ингибирования b -окисления в пероксисомах [Miyajima et al., 1998]. При патогистологическом исследовании биоптатов печени пациентов выявлены массивные отложения железа [Loreal et al., 2002].

21 мутация в гене ЦП была обнаружена у 24 семей со всего мира [Miyajima et al., 2003], в Японии частота оценивается как 1/2 000 000 неродственных браков [Miyajima et al., 1999]. Замена P177R приводит к задержке синтезированного ЦП в ЭПР, замена по гомологичному амк.о. в F VIII приводит к гемофилии А [Hellman et al., 2002]. Экспериментально получены мыши, гомозиготные по утрате гена ЦП, у которых развивается картина ацерулоплазминемии с выявлением нарушения обмена железа на гистологических препаратах [Harris et al., 1999].

В плазме крови в норме ЦП содержится в концентрации 0.20-0.40 мг/мл. Понижение уровня ЦП может быть обусловлено: болезнью Вильсона-Коновалова, синдромом Менкеса, ацерулоплазминемией, тяжелыми заболеваниями печени, снижением абсорбции меди, потерями с общим белком плазмы через кишечный или мочеполовой путь, а повышение уровня ЦП: хроническими воспалительными процессами, онкологическими заболеваниями, меланомой, шизофренией, инфарктом миокарда, поздними сроками беременности [Gutteridge & Stocks, 1981].

С недавнего времени ЦП стал медицинским препаратом, он используется как основной антиоксидант крови, стимулятор гемопоэза [Shimizu, 1979], уменьшающий интоксикацию и иммунодепрессию [Saenko et al., 1994; Бердинских и др., 1984; Сенюк и др., 1994].