Новая экспериментальная модель
 для изучения человеческих
эндотелиальных клеток

Исследованиями последних лет были выявлены взаимосвязи между процессами воспаления и ангиогенеза. Ангиогенез это процесс формирования новых капилляров из предсуществующих сосудов за счет миграции и пролиферации эндотелиальных клеток. Ангиогенез лежит в основе многих физиологических и патологических процессов. Ангиогенез активно идет в период эмбриогенеза, заживления ран, в связи с менструальным циклом у женщин. При этих физиологических процессах ангиогенез регулируется. Нерегулируемый ангиогенез наблюдается при патологических условиях таких как опухолевый рост, диабетическая ретинопатя, псориаз, ревматоидный артрит. Прогрессирование ангиогенеза контролируется балансом позитивных и негативных регуляторов этого процесса. Для запуска ангиогенеза необходимо либо усиление продукции проангиогенных факторов, либо снижение уровня ингибиторов. К настоящему времени накопились в литературе данные о том, что воспалительные клетки и продуцируемые ими медиаторы, в частности, цитокины, хемокины и ферменты могут облегчать ангиогенез и способствовать росту, инвазии и метастазированию опухолей. С этим связана актуальность задачи изучения свойств эндотелиальных клеток и их изменений под влиянием цитокинов.

В настоящее время в исследованиях используются различные экспериментальные модели эндотелиальных клеток (EC), позволяющие изучать их свойства in vitro.
Первичные культуры EC имеют ограниченный срок жизни и отличаются широкой вариабельностью результатов, которая зависит от особенностей доноров.
Существенными преимуществами обладают перевиваемые линии EC.
Одной из наиболее полно охарактеризованных перевиваемых линий человека является перевиваемая линия человеческих эндотелиальных клеток EA. Hy 926, которая была любезно предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной Каролины, США). По морфологическим, биохимическим, функциональным и генетическим характеристикам клетки этой линии чрезвычайно близки эндотелиальным клеткам макрососудов человека.

Рис.1

Рис.2

Целью нашего исследования было оценить пригодность перевиваемой линии EA. Hy 926 для изучения свойств эндотелиальных клеток в условиях in vitro, максимально приближенных к условиям in vivo.
Полученные нами результаты показали, что перевиваемая линия человеческих эндотелиальных клеток EA. Hy 926 является удобной моделью для изучения пролиферативной активности клеток и влияния на пролиферацию ростовых факторов. Проведенные фундаментальные исследования могут лечь в основу создания новой модельной системы для проведения скрининга и более детальных испытаний различных препаратов с потенциальным проангиогенным или антиангиогенным действием. Использованные нами методы быстрого и точного определения количества жизнеспособных клеток и активности их пролиферации могут быть с успехом применены в различных экспериментальных исследованиях.

  • Для этой цели может быть рекомендован вариант иммуноферментного анализа, позволяющий количественно оценить уровень включение в пролиферирующие клетки аналога тимидина – 5-бром-2’-дезоксиуридина(BrdU).

  • Кроме того, с помощью проточной цитометрии активность пролиферации клеток может быть оценена методом, основанным на окраске внутриклеточного белка флуоресцентным красителем CFSE, который при делении клетки равномерно кратно распределяется между дочерними клетками (рис.3).

Рис.3 : Гистограмма, отражающая сравнение интенсивности свечения по FL1 окрашенных флуоресцентным красителем CFSE эндотелиальных клеток линии EA.Hy926, культивировавшихся в ростовой среде (более темная кривая) и в такой же среде с добавлением антипролиферативного агента - эпирубицина (более светлая кривая).

Эндотелиальные клетки EA. Hy 926, как было показано, экспрессируют широкий спектр поверхностных молекул, участвующих в многочисленных функциях EC. Использованные методы количественной оценки колебаний уровня экспрессии этих молекул могут быть использованы при изучении изменений свойств EC под влиянием биологически активных веществ

Эта же перевиваемая линия человеческих эндотелиальных клеток может быть использована для изучения влияния испытуемых препаратов:

  • на продукцию и секрецию эндотелиальными клетками ключевых цитокинов, хемокинов и ферментов,

  • на миграционную активность эндотелиальных клеток,

  • на процесс формирования трубок в Матринеле, моделирующий процесс ангиогенеза в целом.

Та же перевиваемая линия эндотелиальных клеток человека EA.Hy926 была нами использована для конструирования модельной системы трансэндотелиальной миграции мононуклеарных клеток крови человека. В качестве модельных моноцитов использовали клетки моноцитоподобной линии THP-1, которые по своему генотипу и фенотипу очень близки к моноцитам периферической крови человека.
Использование такой модельной системы позволяет изучить взаимное влияние трансмигрирующих моноцитов и эндотелиальных клеток, изменения поверхностного фенотипа и свойств моноцитов при трансэндотелиальной миграции, влияние цитокинов и других биологически активных молекул на процесс трансэндотелиальной миграции.

В качестве конкретного примера такого рода исследований приводим описание результатов изучения изменений поверхностного фенотипа моноцитоподобных клеток линии THP-1, сопряженных с трансэндотелиальной миграцией.

Введение. Для осуществления своих функций лейкоциты постоянно мигрируют из кровеносного русла в ткани. В процессе миграции в субэндотелиальное пространство свойства лейкоцитов изменяются. Например, повышается экспрессия активационных маркеров, костимуляторных, адгезионных молекул, усиливаются пролиферативная, цитотоксическая активность и жизнеспособность мигрирующих клеток. Моноциты после миграции в ткани способны дифференцироваться в макрофаги, миелоидные дендритные клетки, остеокласты, клетки микроглии и выполнять множество разнообразных функций, направленных на поддержание гомеостаза. Процесс трансэндотелиальной миграции моноцитов находится под контролем множества эндогенных и экзогенных факторов, в частности, цитокинов. Мы изучали изменения поверхностного фенотипа моноцитоподобных клеток линии THP-1 при трансэндотелиальной миграции через монослой эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.hy 926 в присутствии или в отсутствие цитокинов: TNFα, IFNγ и IL-4.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.

Клетки линии EA.Hy 926 культивировали в среде DMEM/F12 («Биолот», СПб, РФ), содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина (АО «Самсон», СПб, РФ) и 2 mM L-глютамина («ICN», США) и HAT («ICN», США) при 370C во влажной атмосфере с 5% CO2. Для дезинтеграции монослоя клетки инкубировали в растворе Версена («Биолот», СПб, РФ) в течение 5-10 минут. Человеческие моноцитоподобные клетки линии THP-1 культивировали в среде RPMI-1640 («Биолот», СПб, РФ), содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина (АО «Самсон», СПб, РФ) и 2 mM L-глютамина («ICN», США), при 370C во влажной атмосфере с 5% CO2. Пересев производили 1 раз в 3-4 дня. Клетки всех перевиваемых линий имеют подтвержденную принадлежность к соответствующим линиям. Во всех экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 98%.

Эндотелиальные клетки линии EA.hy 926 вносили в трансвеллы (Becton Dickinson, США) с диаметром пор 8 мкм (Рис.1) в концентрации 50000 клеток в 150 мкл полной культуральной среды DMEM/F12 («Sigma», США) и инкубировали во влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С до образования конфлюэнтного монослоя, который оценивали микроскопически. В верхние камеры трансвеллов (над монослоем эндотелиальных клеток) вносили клетки линии THP-1 по 300000 в 150 мкл среды DMEM/F12, содержащей 1,5% FCS («ICN», США). В нижние камеры вносили по 350 мкл такой же среды DMEM/F12 («Sigma», США), содержащей или не содержащей цитокины. В параллельных экспериментах клетки линии THP-1 вносили в верхние камеры трансвеллов, не содержащие эндотелиальных клеток, при наличии или отсутствии цитокинов в нижней камере. В работе использовали рекомбинантные препараты человеческих цитокинов TNFa - «Рефнолин» (специфическая активность препарата 1ЕД - 0,06 нг) в концентрации 50 ЕД/мл, IFNg - «Гаммаферон» (НПО «Фермент», «Sanitas», Литва) в концентрации 500 ЕД/мл, IL-4 (специфическая активность препарата 1ЕД – 0,2 нг) в концентрации 50 ЕД/мл («Becton Dickinson», США). Цитокины в указанных концентрациях не проявляли цитотоксического действия на используемые в работе клетки.

Схема опыта

После инкубации в течение 72 часов во влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С все содержимое нижней камеры собирали и проводили оценку экспрессии поверхностных молекул. Антитела анти-CD11b, меченные PE, анти-HLA-DR, поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные FITC («МедБиоСпектр», РФ) и анти-CD14, меченные PerCP («Becton Dickinson», США) добавляли к клеткам и инкубировали в соответствии с рекомендациями производителя. Интенсивность флюоресценции оценивали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson», (США). Результаты выражали средними значениями интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity - MFI), которые подсчитывали по результатам не менее трех независимых экспериментов. Для сравнения средних величин использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Проведено сравнительное изучение поверхностного фенотипа клеток THP-1, которые перемещались из верхней камеры трансвелла в нижнюю, проходя через монослой эндотелиальных клеток, с фенотипом клеток THP-1, которые перемещались из верхней камеры трансвелла в нижнюю, не проходя через монослой эндотелиальных клеток. Только в случае трансэндотелиальной миграции на клетках THP-1 достоверно повышался уровень экспрессии молекул CD11b и HLA-DR при неизменном уровне экспрессии молекул CD14 (Рис.4). Чтобы убедиться в том, что фенотипические изменения происходили именно вследствие трансэндотелиальной миграции, мы оценивали фенотип клеток THP-1, которые оставались в верхней камере трансвеллов над монослоем эндотелиальных клеток (находились в контакте с эндотелиальными клетками, но не трансмигрировали). Достоверных отличий уровня экспрессии поверхностных молекул на клетках THP-1 этой фракции по сравнению с уровнем экспрессии поверхностных молекул на интактных клетках THP-1 выявлено не было.

Изменения поверхностного фенотипа клеток THP-1 при трансэндотелиальной миграции могли быть следствием контактных и/или дистантных взаимодействий с эндотелиальными клетками, поэтому мы изучали зависимость фенотипических изменений при трансэндотелиальной миграции от секреторных и адгезивных свойств эндотелиальных клеток. Согласно данным литературы и нашим предшествующим результатам, цитокины TNFα, IFNγ и IL-4 по-разному влияют на секреторные и адгезивные свойства эндотелиальных клеток. Мы сравнивали фенотип клеток THP-1 после их прохождения через монослой эндотелиальных клеток в присутствии TNFα, IFNγ и IL-4 с фенотипом клеток THP-1 после их перемещения в нижнюю камеру без прохождения через монослой эндотелиальных клеток в присутствии этих же цитокинов. Только в случае трансэндотелиальной миграции в присутствии TNFα и IFNγ наблюдали достоверное повышение экспрессии всех исследуемых маркеров CD11b, HLA-DR и CD14 (Рис. 5,6).

Изменения при трансэндотелиальной миграции в присутствии TNFα были выражены сильнее, чем изменения при трансмиграции в присутствии IFNγ. Трансэндотелиальная миграция в присутствии IL-4 вызывала достоверное повышение уровня экспрессии CD11b и HLA-DR, а уровень экспрессии CD14 достоверно не отличался от уровня экспрессии этой молекулы на клетках THP-1, которые мигрировали без монослоя эндотелиальных клеток,: в присутствии IL-4 в нижней камере (Рис. 7).

Влиянию цитокинов подвергались не только эндотелиальные, но и взаимодействующие с ними клетки THP-1. Поэтому мы сравнивали поверхностный фенотип клеток THP-1, переместившихся из верхней камеры в нижнюю без прохождения через монослой эндотелиальных клеток в присутствии цитокинов, с фенотипом клеток THP-1, мигрировавших в аналогичных условиях, но в отсутствие цитокинов в нижней камере. При этом изменения поверхностного фенотипа были незначительны и достоверны только в случае присутствия IFNγ  (Табл.1).

Дифференцировка мононуклеарных фагоцитов является одним из ключевых моментов развития воспаления и иммунного ответа. Полученные нами результаты показывают, что при трансэндотелиальной миграции повышается экспрессия поверхностных маркеров, ассоциированных с дифференцировкой, на мигрирующих в субэндотелиальное пространство моноцитоподобных клетках линии THP-1 (Рис.8). В случае трансэндотелиальной миграции в присутствии провоспалительных цитокинов эти изменения значительно более выражены (Рис.9), что можно объяснить повышением чувствительности мигрировавших в субэндотелиальное пространство клеток к действию цитокинов. Полученные нами результаты свидетельствуют о существенном вкладе эндотелиальных клеток в регуляцию дифференцировки мононуклеарных фагоцитов.

Рис.4.Сравнение уровней экспрессии поверхностных молекул на клетках THP-1, которые мигрировали через монослой эндотелиальных клеток (трансмиграция) или без такового (миграция), без цитокинов.

 

Рис.5.Сравнение уровней экспрессии поверхностных молекул на клетках THP-1, которые мигрировали в присутствии TNFα через монослой эндотелиальных клеток или без такового.

 

Рис.6.Сравнение уровней экспрессии поверхностных молекул на клетках THP-1, которые мигрировали в присутствии IFNγ через монослой эндотелиальных клеток или без такового.

 

Рис.7.Сравнение уровней экспрессии поверхностных молекул на клетках THP-1, которые мигрировали в присутствии IL-4 через монослой эндотелиальных клеток или без такового.

*** (p<0,001), **(p<0,01) *(p<0,05).

 

Рис.8. Экспрессия поверхностных молекул на клетках THP-1, которые трансмигрировали через монослой эндотелиальных клеток (гистограмма красного цвета) по сравнению с клетками, которые мигрировали в отсутствие монослоя эндотелиальных клеток в тех же условиях а) экспрессия HLA-DR, b) экспрессия CD11b, c) экспрессия CD14.

 

Рис.9. Экспрессия поверхностных молекул на клетках THP-1, которые трансмигрировали через монослой эндотелиальных клеток, инкубируемый в присутствии TNFα (гистограмма красного цвета) по сравнению с клетками, которые мигрировали в отсутствие монослоя эндотелиальных клеток в тех же условиях, а) экспрессия HLA-DR, b) экспрессия CD11b, c) экспрессия CD14.

Работа поддержана грантом РФФИ № 06-04-48110.

 

 лаб. иммунорегуляции